194497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganattal és vírussal szembeni immunválasz kiváltására alkalmas kompozíció előállítására
9 194497 10 tűk melanómasejtekből nyert extraktummal, amelyről ismert, hogy nem köti az MAb 17-lA-t. A CRC sejtextraktumokról 0,1, illetve 0,5 mg/ml koncentrációban azt találtuk, hogy gátolták a 23. számú betegtől származó anti-idiotípus antitest kötődését a jódozott MAb 17-lA-hoz 39%-ban, illetve 68%-ban. A melanómasejtekből származó extraktum 0,5 mg/ml koncentrációig nem hatott szignifikánsan a monoklonális antitest kötésre. A kötési reakciónak ez a haptén-gátlása jelzi a CRC epitop „belső-képmás”-ának jelenlétét az anti-idiotípus antitesten. Ezt támogatja még az a tény is, hogy úgy találtuk, hogy a CRC sejtek extraktuma nem kötődik az anti-idiotípus antitestekhez, de kötődik, amint ez várható, a MAb 17-lA-hoz. Anti idiotípus- és anti-(anti-idiotipus) antitestek termelése humán B-limfociták által A 08. számú, illetve a 23. számú betegekből „buffy coat” sejteket nyertünk 20, illetve 5 hónappal az MAb 17-lA-val végzett injekció után. A sejteket 10 ng/ml 17-1A F/ab’/2 fragmenssel in vitro stimuláltuk, amint ezt De Freitas és munkatársai leírták [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79,6646-6650 (1982)1 Az ezt követő hét nap folyamán a sejtek alikvotjait szétválasztottuk T- és B- sejt populációkra 2-amino-etil-izouronium-bromiddal kezelt birka-eritrocitákkal végzett rozetta-képzéssel [lásd: Pellogrino és munkatársai: Clin. Immunoi, and Immunopathol. 3, 324-333 (1975)1 Mindkét sejtpopulációt megfestettük 17-1A F/ab’A fragmenseivel vagy anti-influenza monoklonális antitesttel, és kecske antiegér Ig-FITC-vel. A sejtpopulációkat ezután citofluorográfban elemeztük. Ezenkívül azonos betegből származó perifériás vér mononukleáris sejteket stimuláltunk 17-1A F/ab’/2 fragmenseivel vagy anti-influenza monoklonális antitestekkel kilenc napon át, fajlagos humán lg termeléséhez szolgáló módosított Mishell- Dutton tenyészetben, amint ezt DeFreites és munkatársai leírták, lásd fentebb idézett munkát. Ezekből a tenyészetekből nyert felülúszókat mértük fajlagos humán IgG-hez szolgáló szilárd fázisú enzimhez kötött immun-abszorbens méréssel (KPL Laboratories, Gaithersburg, Maryland). A limfociták százaléka, amely a 08. számú beteg 17-1A F/ab72-jéhez a kiindulásnál kötődött, 1,2% volt, míg a 23. betegnél 0,2% volt. Hét nap folyamán MAb 17-lA-val való tenyészetben a 23. számú beteg limfocitáinak, amelyek fajlagosan kötik a 17-1A F/ab’/2-jét, százaléka 0,2%-ról 13%-ra növekedett. Az összes 17-1A kötősejt a B-sejt populációban volt jelen. Ezenkívül kilenc nap után humán anti-MAb 17-1A IgG-t mutattunk ki. Azonos betegből származó limfociták inkubálása anti-influenza monoklonális antitesttel, azonos körülmények között, nem termel kimutatható humán Ig-t sem MAb 17-ÍA-ra, sem anti-influenza monoklonális antitestekre. Egy másik kísérletben humán B-Iimfocitákat stimuláltunk, hogy anti-(anti-idiotípus) antitestet állítsunk elő. B-limfocitákat gyűjtöttünk és stimulálunk in vitro, amint ezt fentebb leírtuk, azzal az eltéréssel, hogy a sejteket autológ anti-idiotípus antitesttel stimuláltuk idíotípus antitest helyett. Anti-(anti-idiotípus) antitesteket állítottunk elő stimulált B-limfocitákkal, és ezekről az anti-(anti-Id) Ab-ről kimutattuk, hogy epitopok CRC sejtextraktumokban és teljes sejteken. A humán immunrendszer tehát antitumor antitesteket állít elő antiidiotípus antitestekkel való stimulálásra adott válaszban. Anti-idiotípus antitesteket termelő, nem pusztuló B- limfociták Monoklonális antitesteket kiválasztó nem pusztuló B-limfociták előállítására különböző módszerek ismeretesek a szakirodalomban, lásd. pl. Kozbor és munkatársai: Immunology Today, 4,72-79 (1983). Anti-(antiidiotípus) antitesteket kiválasztó humán B-limfocitákat, amelyeket a fentebb leírt módon perifériás vérlimfocitákból nyertünk, ennél fogva a szakterületen jártasságnak megfelelően lehet nem pusztulóvá tenni. Az egyik módszer, amelyet könnyen alkalmazni lehet, a nem pusztulóvá tétel Epstein-Barr vírussal (EBV). Ebben a módszerben a fentebb leírt normál limfocitákat EBV-vel fertőzünk in vitro, és a nem pusztuló sejtvonalakat ezután tenyésztjük pl. korlátozott hígítással tápanyagrétegen, lásd pl. Kozbor és munkatársai (1983), fentebb idézett munka, és az ebben idézett 51-60. irodalmi helyek. Egy másik megközelítés vagy a fentebb leírt anti-Id Ab-t kiválasztó limfociták vagy egy EBV-vel transzformált limfocita fuzionálása egy humán plazmacitóma vagy limfoblasztoid fúziós partnerrel. így pl. egy anti-Id Ab-t kiválasztó, EBV-vel transzformált B-limfocitát fuzionálhatunk pl. a KR-4 humán limfoblasztoid sejtvonallal. A kívánt hibridómákat azután ouabaint tartalmazó hipoxantin-aminopterin-timidin tápközegben kell szelektálni, amely eltávolítja a szülő sejteket. A hibridómákat fajlagos antitest termelésre vizsgáljuk. A pozitív hibrideket azután klónozzuk, újra klónozzuk, majd nagybani tenyészetben sokszorozzuk, vagy egy immunológiailag visszaszorított emlős hasüregében (pl. meztelen egérben) sokszorozzuk, lásd. pl. Kozbor és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 6651-6655 (1982). 2. példa. Vírus antitestek Anti-idiotípus antitest készítése Különböző monoklonális antitestek (mAb) ellen; anti-idiotípus antitestnek (anti-Id Ab), a veszettségvírus glikoprotein (G) epitopjait helyreállító képességét vizsgáltuk. Ez a G felelős a veszettségvírus fő biológiai tulajdonságainak legtöbbjéért, beleértve a vírus-közömbösítő antitestek (VNA) indukcióját. Jelenleg pontosan nem ismeretes, a G-nek melyik része felelős ezért a funkcióért. A veszettségvírus-G kihívó vírus standardjára vonatkozó (CVS) funkcionális epitop térképet írtak le Lafon és munkatársai (J. Gen. Virol. 64, 843-851 (1983), amely legalább három fő antigén helyet sejtet a fajta-specifikus VNA-hoz. Öt anti-G mAb-t választottunk ki hibridómáknak egy nagy paneljéből izotípusuk (amely Protein A-Sepharose kromatográfiával végzett tisztítást tesz lehetővé) és a veszettségvírus-G-n levő kötőhelyük alapján, amint ezt a funkcionális epitop térképpel meghatározzuk. Az 509-6; 101-1; 507-1 és 719-3 anti-veszettség vírus G mAb-ket már korábban leírták [Lafon és munkatársai, fentebb idézett munka; Wiktor és munkatársai: J. Exp. Med. 152, 99-112 (1980)1 Ezek az mAb-k, amelyek erősen közömbösítik a veszettségvírus fertőzőképességét, a következő jellemzőkkel bírnak: 509-6 (epitop térképhely I; IgG2a); 101-1 (epitop térképhely II b; IgG2a/; 507-1 (epitop térképhely III b; IgGl), és 719-3 (epitop térképhely II c; IgG2a). Anti-G mAb 1104—2-t (IgGl) nyertünk veszettségvírussal immuni5 ^0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
