194496. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Marek-kór elleni élő vakcina előállítására
7 194 496 8 II. PÉLDA Hasonló ártalmatlansági vizsgálatot RIR csirkéket alkalmazva, ahogyan az I. példában leírtuk, hajtunk végre két, találmány szerinti CEF-hez adaptált készítménnyel (CVI-988 CEF« „C” MDV-klón és CVI-988 CEFs4 „C” MDV-klón). CVI-988 CEF65 „C” MDV-klón: 20 RIR csirkét, amelyet a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból keltünk ki, inokulálunk intramuszkulárisan 10000 FFU-val, közvetlenül keltetés után. A csirkéket módosított Horsefall-Bauer-izolátorokban tartjuk. Tíz hét múlva az inokulálástól számítva 6 csirkét távolítunk el az izolátorból (5 kakas, 1 tyúk) és felboncoljuk. A timuszon, Fabricíus-tömlőn, májon, lépen, mind a bolygó-, mind a bordaközi idegeken, valamint a légcsövi és csípőidegeken, továbbá a nervus plexiken mindkét oldalon végzünk szövettani vizsgálatot. A 24 hetes megfigyelési periódus után a vizsgálatot a 10 megmaradó nőstény csirkén végzett boncolással fejezzük be. A szövettani vizsgálathoz kiválasztott szövetek szintén a fent leírtak. A Marék-kórnak sem klinikai, sem makroszkópos jelei, sem MD-vel társuló szövettani elváltozások nem figyelhetők meg a 16 vizsgálati csirke egyikén sem. CVI-988 CEF59 „C” MDV-klón: 13 RIR csirkét, amelyeket a Wickham Laboratoriestől kapott SPF RIR-tojásokból keltünk ki, inokulálunk 10 000 FFU-val közvetlenül a keltetés után. A csirkéket módosított Horsefall-Bauer-izolátorokban tartjuk. Két csirke pusztul el nem fajlagos okokból. 24 hetes vizsgálati időtartam után a vizsgálatot a fennmaradó 11 csirkén végrehajtott boncolással fejezzük be (5 és 6 ). A11 csirke egyikén sem figyeljük meg a Marek-kór klinikai vagy makroszkópos jeleit. Szövettani megfigyelést hajtunk végre a timuszon, a Fabricius-tömlőn, a lépen, májon, mind a bolygó-, mind a bordaközi idegeken, valamint a légcsövi és csípőídegeken, és a nervus plexin mindkét oldalon. Egy csirkében ( ) limfoid hiperplázia figyelhető meg a májban. Tömlőfuggő tüszős szerkezeteket figyelünk meg, ezért az elváltozások nem tekinthetők neoplasztikusnak. III. PÉLDA Hasonló ártalmatlansági vizsgálatot végzünk RIR csirkéket alkalmazva, amint ezt az I. és II. példákban leírtuk, „A”, „B” és „C” kiónokkal, amelyek mind a CVI-988 DEF MDV 48. passzázsából erednek (mind a „C”’ klón, mind a „C” klón a 49. DEF passzálásban levő azonos tarfoltból származnak). Ezenkívül „D” kiónt is vizsgálunk. CVI-988 CEF63 MDV „A” klón: 16 RIR csirkét, amelyek a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10000 FFU-val közvetlenül a keltetés után. A vizsgálati módszer azonos, mint a H. példában leírt módszer. Marek-kór klinikai vagy makroszkópos jeleit nem észleljük. A szövettani vizsgálatban azonban gyulladásos elváltozásokat, Payne és Biggs szerinti [J. Natl. Cancer Institute 39,281-302 (1967)] B típusú elváltozásokat figyelünk meg a 24. héten boncolt 10 csirkéből egynek a nervus plexijében. CVI-988 CEF62 MDV „B" klón: 18 RIR csirkét, amelyek a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10000 FFU „B” kiónnal. A vizsgálati módszer azonos mint a II. példában leírt módszer. A Marék-kórnak sem klinikai, sem makroszkópos jelei, sem MD-vel társuló szövettani elváltozások nem észlelhetők a 18 vizsgált csirke egyikében sem. CVI-988 CEF67 MDV „C” klón: 14 RIR csirkét, amelyek a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10 000 FFU „C”” klónnal, amely DEF- ben végzett passzálásokon ment keresztül az 54. paszszálásig. A vizsgálati módszer azonos, mint a II. példában leírt módszer. A Marek-kómak sem klinikai, sem makroszkópos jelei, sem MD-vel társuló szövettani változások nem észlelhetők a 14 vizsgált csirke egyikében sem. CVI-988 CEF59 MDV „C”” klón: 13 RIR csirkét, amelyek a Wickham Laboratories-től kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10000 FFU-val közvetlenül a keltetés után. 24 hetes megfigyelési időszak után a vizsgálatot boncolással fejezzük be. Három csirke nem fajlagos okokból elpusztul, ezért a boncolást a megmaradó 10 csirkén végezzük el (6 és 4 ). Marek-kómak sem klinikai, sem makroszkópos jeleit nem figyeljük meg a 10 csirke egyikében sem. Szövettani vizsgálatot végzünk a timuszon, a Fabricius-tömlőn, májon, mind a bolygó-, mind a bordaközi idegeken, valamint a légcsövi és csípőidegeken, és a nervus plexin mindkét oldalon. Egy csirkében ( ) gyulladásos, B típusú elváltozást észlelünk a csípőidegen. CVT-988 DEF97 MDV „D” klón: 20 RIR csirkét, amelyek a Houghton Poultry Research Station-tól (Anglia) kapott SPF RIR-tojásokból kelnek ki, intramuszkulárisan inokulálunk 10 000 FFU „D” kiónnal. Ellentétben az „E” klónnal, ez a „D” klón csak DEF-ben végzett sejttenyésztési passzálásokon megy keresztül, és a tarfolt-tisztítási lépéseket a 87. és 94. passzálások között hajtjuk végre. Két csirke pusztul el nem fajlagos okokból. A vizsgálati eljárás hasonló az I. példában leírt eljáráshoz. A Marek-kómak sem klinikai, sem makroszkópos jeleit, sem MD-vel társuló szövettani elváltozásokat nem figyelünk meg a 18 vizsgált csirke egyikén sem. Védő hatékonysági tanulmányok. Egy vakcinakészítmény immunogén tulajdonságait a legpontosabban egy 50% védődózis (PDS0) méréssel [journal of Biological Standardization 9, 15-22 (1981)] határozzuk meg. A PDJ0-et úgy határozzuk meg, mint a tarfolt- vagy gócképző egységek (focus forming unit, FFU) számát - in vitro vizsgálatban meghatározva -, amely az SPF csirkék csoportja (MD-fogékony részének 50%-ának megvédéséhez szükséges a Marek-kór klinikai tünetei és elváltozásai ellen. A kihívást jelentő fertőzést életük 9. napján hajtjuk végre virulens MDV intramuszkuláris injekciójával olyan dózisban, amelyről ismert, hogy nem vakcináit csirkék több mint 70%-ában MD-elváltozásokat idéz elő 10 hetes megfigyelési időszak alatt. Az így nyert vizsgálati eredményeket statisztikailag lehet feldolgozni egy számítógép-program segítségével, amelyet az UCLA Health Sciences Computing Facili-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
