194408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vankomicinek csoportjába tartozó antibiotikumok meghatározására szilárd fázisú receptoron az ennek végrehajtásához szükséges hordozó eszközök és anyagkészlet
1 zandó vegyük tét fölös mennyiségű „kötődési helylyel" hozzuk egyensúlyi helyzetbe, majd a még rendelkezésre álló kötődési helyek teljes telítésére .jelzett meghatározandó vegyületet” adagolunk. Mint a szakember számára nyilvánvaló, a találmány szerinti módszer esetében a kötődési helyeket az ün. molekuláris receptorok - azaz az analízishez használt „hordozó vagy tárolló eszközök” felületén adszorbeálódott D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptid konjugátum - képviselik. A .jelzett meghatározandó vegyület” kifejezés olyan meghatározandó vegyük tre vonatkozik, amelyet valamilyen ismert .jelző” eljárással - pl. radioaktív jelzők vagy előnyösen enzimek alkalmazásával — jelzetté tettünk. A radioaktív jelzők megegyeznek a radio-immunológiai vizsgálatok során általánosan alkalmazott anyagokkal (ilyen pl. a ,2SI), míg az enzimes marker azok közül kerülhet ki, amelyeket az enzimek felhasználásán alapuló immun-vizsgálatok körében alkalmazunk. Kitüntetett enzimes marker a torma-peroxidáz. Ha a .jelzett meghatározandó anyag” enzimesen jelzett, a kimutatást előnyösen kolorimetriás méréssel végezzük, egy megfelelő kromogén szubsztrátum jelenlétében. A radioizotópos jelölés esetében a szokásos szcintillográfiás meghatározási technikát alkalmazzuk. A találmány egyik tárgya tehát eljárás egy meghatározandó anyag — egy, a vankomicin osztályba tartozó antibiotikum, ennek egy különálló faktora, származéka, aglükonja - meghatározására, amelyek rendelkeznek azzal a közös tulajdonsággal, hogy kötődnek a D-alanil-D-alanin dipeptid vagy egy D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptid által képviselt „molekuláris receptorhoz”. Ez az eljárás a következő lépéseket foglalja magában: az elemzéshez használt .hordozó és/vagy tároló eszközök” műanyag felületére meghatározott mennyiségű D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptidet abszorbeáltatunk, amelyet az adott felületre abszorbeálódni képes makromolekuláris polipeptid hordozóval konjugáltattunk; a rendszerhez egyidejűleg vagy egymás után hozzáadjuk a meghatározandó mintát és ismert mennyiségű jelzett meghatározandó vegyületet és egy standard görbe alapján - amelyet ismert mennyiségű meghatározandó vegyület meghatározása alkalmával vettünk fel - meghatározzuk a szilárd fázisú rendszerhez kötődő jelzett meghatározandó anyag menynyiségét. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptid és a megfelelő hordozó összekapcsolása ismert eljárások szerint végezhető. Célszerűen egy kapcsoló szert alkalmazunk; egy kitüntetett kapcsoló szer a glutáraldehid. Más ismert kapcsoló szerek: a karbodiimidek, diizocianátok, anhidridek, diazónium-vegyületek, azidok és a brómcián. Hasonlóképpen ismert kapcsoló eljárások és reagensek - pl. a fent említettek — alkalmazhatók a Jelző enzimnek" a meghatározandó anyaghoz való kötésére, a Jelzett meghatározandó vegyület” előállítása során. Ebben az esetben is a glutáraldehid a kitüntetett kapcsoló szer. Ezekben a kapcsolási reakciókban a reagensek aránya nagyon jelentősen változhat, bár sok esetben előnyben részesítjük az 1:1 arányt a Jelző enzim” és a meghatározandó anyag, illetőleg a D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptid és a hordozó között. Ha a kapcsolási reakció az epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala, mint D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptid 2 és szarvasmarha szérum albumin (BSA), mint makromolekuláris hordozó között megy végbe, e két reagens mólaránya 1:1-10:1 között változhat. A találmány szerinti módszer esetében a kompetitiv vizsgálat a következő lépéseket foglalja magában: a) az elemzéshez használt ,.hordozó és/vagy tárdó eszközök” felületére passzíve abszorbeáltatunk egy megfelelő makromdekuláris polipeptid hordozóval- amely az említett felületekre abszorbeálódni képes- konjugált D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptidet; b) az elegyhez hozzáadjuk a meghatározandó mintát, valamint ismert mennyiségű Jelzett meghatározandó anyagot”, és a rendszert inkubáljuk; c) meghatározzuk az elemzéshez vett mintában a meghatározandó anyag mennyiségét olymódon, hogy egy ismert mennyiségű meghatározandó anyagot tartalmazó minták segítségével felvett standard görbe alapján értékeljük a szilárd fázisú rendszerhez kötődő Jelzett meghatározandó anyag” mennyiségét. A találmány szerinti módszer egyik kitüntetett foganatosítási módja esetében D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptidként epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-t használunk. A találmány egy másik kitüntetett foganatosítási módja szerint a műanyag-felületre abszorbeálódni képes makromolekuláris hordozóként szérumalbumint, előnyösen szarvasmarha szérumalbumint (BSA) alkalmazunk. A találmány egy további kitüntetett foganatosítási módja keretében enzimmel jelzett meghatározandó anyag szolgál Jelzett meghatározandó anyag”ként. A kitüntetett Jelző” enzim a torma-peroxidáz. A találmány szerinti módszer egy további, előnyben részesített foganatosítási módja szerint a módszert teikoplanin és egy teikoplanin származék, aglükon vagy pszeudoaglükon meghatározására alkalmazzuk. A találmány szerinti módszer egy további konkrét foganatosítási módját egy kompetitiv eljárás képviseli teikoplanin vagy vankomicin osztályba tartozó valamely más antibiotikum, ezek egy elkülönített faktora, származéka vagy aglükoftja humán szérum mintákban való meghatározására, amely a következő lépésekből áll: a) foszfát puffer sóoldat (PBS), szarvasmarha szérumalbumin (BSA) és egy felületaktív szer - pl. polietilénoxid-szorbitán-monolaurát (Tween® 20) — felhasználásával egy pH 7,0-7,5 hígító pultért készítünk el; b) a vizsgálandó antibiotikumokból skaláris standard hígításokat készítünk (beleértve a nulla értéket is) foszfát puffer sóoldat (PBS) és hígított szérum, pH 7,0-7,5 felhasználásával; c) a meghatározandó szérum mintákat az előbbi higító puffer alkalmazásával a kiválasztott higítási értékre állítjuk be; d) mindegyik mintához tormaperoxidáz-meghatározandó anyag konjugátumot tartalmazó oldatot adunk, az anyagokat összekeverjük; e) ezeket a keverékeket egy - korlátozott mennyiségű BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-val bevont - mikrotitráló lemez műanyag mélyedéseibe visszük át; 0 a lapokat kb. 2 órán át szobahőmérsékleten nedves kamrában inkubáljuk, majd a mélyedéseket alaposan mossuk 0,05-0,1 térfogat% Tween® 20-at tartalmazó pH 7,0-7,5 PBS-sel; Í[) az elegyhez hozzáadjuk a torma-peroxidáz valay kromogén szubsztrátumát, szín kifejlesztésére, 194.408 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
