194408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vankomicinek csoportjába tartozó antibiotikumok meghatározására szilárd fázisú receptoron az ennek végrehajtásához szükséges hordozó eszközök és anyagkészlet
1 és h) spektrofotometriásán meghatározzuk a minták optikai sűrűségét, majd i) meghatározzuk a keresett anyag koncentrációját a vizsgálatra vett mintákban, számítás segítségével olymódon, hogy az egyes minták kompetíciós arányát interpoláljuk a standardokkal kapott kalibrációs görbén. A kompetíciós arányt úgy definiáljuk, mint a minta specifikus optikai sűrűsége és a nulla standard optikai sűrűsége arányát. Az előbbi eljárás az űn. „versengéses” kötődési vizsgálatot képviseli, amely azzal a körülménnyel jellemezhető, hogy a rendelkezésre álló kötődési helyek száma összesen kisebb, mint az egyes mintákban jelenlévő meghatározandó anyag és a jelzett meghatározandó anyag által igényelt mennyiség összesen. Ez a módszer azonban módosítható és felhasználható egy „sorozat-telítési” vizsgálat keretében, amely kétlépéses kötődési reakciót foglal magában. Az első lépésben a standardban vagy a vizsgálathoz vett mintában jelenlévő meghatározandó anyaf;ot egyensúly eléréséig fölös mennyiségű BSA-epszion-Aca-D-Ala-D-Ala-val reagáltatjuíc, míg a második lépésben, mosás után, a reakcióelegyhez hozzáadjuk az enzimmel jelzett meghatározandó anyagot, a fennmaradó kötődési helyek telítésére. A megkötött enzim-aktivitás a megfelelő kromogén szubsztrátum alkalmazása segítségével állapítható meg. Az elemzéshez vett „hordozó és/vagy tároló” eszközök, amelyeket a felületükre abszorbeálódni képes, megfelelő makromolekuláris polipeptid hordozóval konjugált D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptiddel vonunk be, újak és a találmány egy további tárgyát képviselik, ugyancsak újak és a találmány tárgyát képezik a műanyag mikrotitráló üregek vagy csövek, amelyeket a felületükre abszorbeálódni képes, megfelelő makromolekuláris hordozóval konjugált D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptiddel vonunk be. Hasonlóképpen újak, és a találmány egy további tárgyát és kitüntetett foganatosítási módját képviselik a BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-val, mint konjugátummal bevont műanyag mikrotitráló üregek vagy csövek. Közelebbről a találmány szerinti bevont mikrotit ráló lapok vagy csövek olyan műanyag mélyedésekkel vagy csövekkel azonosak, amelyeket 0,025 pg - 1 pg, előnyösen 0,1-0,2 /tg BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala konjugátummal vontunk be. A találmány szerinti „hordozó és/vagy tároló eszközök” manuális és automatizált vizsgálati eljárásokban való felhasználásra egyaránt alkalmasak. Ez a „flexibilitás,” különösen fontos a vég-felhasználó szükségleteinek kielégítése szempontjából. , a. automatizált eljárás ténylegesen rendkívül hasznos lehet sok kezelt beteg klinikai megfigyelésére akár a bevitt gyógyszer terápiás dózisa fenntartása szempontjából, akár a gyógyszer biológiai folyadékokban való eloszlása ellenőrzésére vagy tanulmányozására. A manuális módszer laboratóriumi méretű elemzéshez lehet megfelelő. A találmány magában foglal egy, a találmány szerinti módszer kivitelezésére szolgáló reagens-készletet is valamely, a vankomicin osztályba tartozó antibiotikum, ennek egy elkülönített faktora, származéka vagy aglükonja könnyű, gyón, megbízható és pontos meghatározására, amelyek azzal a közös tulajdonság2 gal rendelkeznek, hogy kötődnek a D-alanil-D-alanin dipeptid vagy egy D-alanil-D-alanin karbbxil-terminális oligopeptid által képviselt „molekuláris receptorhoz”. Ez a készlet a következőket foglalja magában: a) műanyag-felületeken való abszorpcióra képes, megfelelő makromolekuláros polipeptid hordozóval konjugált D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptiddel bevont „hordozó és/vagy tároló eszközök”, az elemzéshez; b) a jelzett meghatározandó anyag és/vagy c) a meghatározandó anyagot tartalmazó standard készítmény. Ha a jelölő anyag enzim, pl. torma-peroxidáz, a készlet tartalmazhat egy kromogén szubsztrátumot is. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a készletben kívánt esetben más komponensek - így puffer-oldatok, kimutatható eszközök stb. - is jelen lehetnek, másrészt a készlet egyes komponensei, ugyanezen felhasználás céljából, külön-külön is rendelkezésre bocsáthatók. A találmány magában foglalja ezeket a külön alakban rendelkezésre bocsátott komponenseket is, az ismertetett módszer szerint való felhasználásra. A találmány további jellemzésére a következő példákat mutatjuk be anélkül, hogy ezek a találmány oltalmi körét korlátozónak lennének tekinthetők. 1. példa A BSA-epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala előállítása a) Az epszilon aminokaproil-D-alanil-D-alanin (epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala) konjugálása szarvasmarha szérumalbuminnal (BSA) Az epszilon-Aca-D-Ála-D-Ala-nak a BSA-val való konjugálását egy kétlépcsős eljárással végezzük, bifunkcionális keresztkötő reagensként glutáraldehid alkalmazásával. 250 mg BSA-t 4,5 ml pH 9,5 0,1 M nátdumkarbonát/hidrogénkarbonát pufferben oldunk. Az oldathoz hozzáadunk 0,5 ml 25%-os vizes glutáraldehid oldatot és a rendszert 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, a reakció lefolytatására. A reakcióelegyet ezután egy éjjelen át 0,9%-os NaCl oldattal szemben dializáljuk. 125 mg epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala-t 0,5 ml 0,5M pH 9,5 nátriumkarbonát pufferben oldunk, ezt az oldatot hozzáadjuk a reakcióelegyhez és az elegyet 6 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. Ezután 0,5 ml 1M lizin oldatot adagolunk és a keveréket 2 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni a nem-reagált aktív csoportok blokkolására. A konjugátumot ezután 7,3 pH-jú, 0,15M nátrium-kloridot tartalmazó 0.05M káiumfoszfát (PBS) ellen dializáljuk. b) A konjugátum gélszűrése Annak érdekében, hogy a konjugátumot megtisztítsuk a nem-reagált anyag-feleslegtől, vagy kismolekulatömegű melléktermékektől, az előbbiek szerint kapott dializált keveréket hűtött Sephacryl S—200 oszlopon vezetjük át (ellenőrzött pórusnagyságú kovalensen kötődő alkil-dextrán és N,N’-metilén-bisz-akrilamid) (Pharmacia Fine Chemicals) (0,8 cm x x 100 cm), amelyet pH 10,4 PBS-sel hozunk egyensúlyba és eluálunk. Az eluációt spektrofotometriásán követjük és rögzítjük a 280 nm-en megfigyelt áteresztési. Az oszlop üres térfogatának megfelelő mennyiségű eluálószenel eluált csúcsnak megfelelő frakciókat (össztérfogat 15 ml) egyesítjük, 1 M HCl-dal sem194.408 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
