194408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vankomicinek csoportjába tartozó antibiotikumok meghatározására szilárd fázisú receptoron az ennek végrehajtásához szükséges hordozó eszközök és anyagkészlet
1 194.408 2 A találmány tárgyat eljárás egy D-alanil-D-alanin dipeptidhez kötődni képes antibiotikus anyag meghatározására, amilyenek a vankomicin osztály glükopeptid antibiotikumai és ezek származékai vagy aglükonjai. A találmány további tárgyát képezik a találmány szerinti módszer kivitelezéséhez használható anyag-készletek (kitek) és eszközök. A teikoplanin név egy, a 4239751 s2. USA-beli szabadalmi leírásban ismertetett antibiotikus anyagnak, a korábban teichomicinnek nevezett vegyületnek a nemzetközi szabad neve (INN). A „vankomicin osztályba” tartozó egyéb antibiotikumnak tekintjük, a vankonticinen kívül a risztocetint, akta-Elanint, teikoplanint, avoparcint, aktinoidint, az L-AM-374, A 477, OA 7653, A 35512 B, A 515668, AAD 216, A 41030, A 47934 jellegű anyagokat, valamint az egyes faktorokat, származékokat és aglükonokat. Ismeretes, hogy a vankomicin és a risztocetin befolyásolja a peptidoglukán szintézisét, amely a baktériumok sejtfalának fő szerkezeti összetevője. Úgy tűnik, hogy ez a hatás — amely a sejtnövekedés gátlásához és végső soron a sejt lizis következtében fellépő pusztulásához vezet — egy specifikus kötéssel függ össze, amely ezen antibiotikumok és a karbonil terminálison egy D-Ala-D-Ala maradékkal rendelkező pentapeptid prekurzor (UDP-N-acetil-muramil-pentapeptid) között jön létre (H.R. Perkins Biochem. J. lll.p. 195, 1969). Újabban azt találták, hogy a teikoplanin ugyanezen mechanizmuson keresztül hat: kötődik az érzékeny baktériumok növekedő tenyészeteiben a peptidoglukánhoz. Közelebbről azt találták, hogy a teikoplanin, a vankomicinhez, risztocetin A-hoz és hasonló antibiotikumokhoz hasonlóan kötődik ahhoz a peptidoglukánhoz, amely a karboxil terminálison egy D-Ala-D-Ala dipeptidet tartalmaz. Ennek folytán valószínűleg gátolja a bakteriális transzpeptidázt és megakadályozza a sejtfal peptidoglukánjában keresztkötések kialakulását. Ezek az antibiotikumok kötődnek a D-alanil-D-alanin dipeptidhez vagy egy D-alanil-D-alanin karboxi-terminálissal1 rendelkező oligopeptidhez is. A vankomicin osztályba tartozó többi antibiotikumról is bebizonyították, vagy feltételezik, hogy ugyanezen mechanizmus szerint fejtik ki hatásukat, ezért képesek kötődni egy D-alanil-D-alanin dipeptidhez vagy egy D-alanil-D-alanin karboxil-terminálissal rendelkező oligopeptidhez. Ennélfogva a D-alanil-D-alanin vagy egy D-alanil- D-alanin oligopeptid .molekuláris receptornak” tekinthető az előbbiekben leírt antibiotikus anyagok vonatkozásában. Az antibiotikumok, és közelebbről a teikoplanin és a vankomicin osztályba tartozó többi antibiotikum meghatározására a korábbiakban ismertté vált módszerek ( 1. pl. az idézett USA-beli szabadalmi leírás) főként TLC-n, HPLC-n és az érzékeny mikroorganizmusokkal végzett biológiai vizsgálatokon alapulnak. Az EP-122.969 számú szabadalmi leírás olyan tisztítási eljárást ismertet, amelyben D-alanil-D-alanint kovalens módon egy hordozóhoz kötve immobilizálnak; az így kapott szilárd mátrixot antibiotikumok affinkromatográfiis tisztítására lehet felhasználni. Néhány ilyen antibiotikum jelenleg kialakult terápiás alkalmazására vagy klinikai vizsgálatának előrehaladott voltára tekintettel szükségessé váltak olyan vizsgálati módszerek, amelyek segítségével ezek az anyagok folyadékokban, különösen biológiai folyadékokban gyorsan, könnyen, megbízható módon és automatizálásra alkalmas módon meghatározhatók. Azt találtuk, hogy a teikoplanin és a többi antibiotikus anyag, amely ugyanazzal a hatásmechanizmussal rendelkezik (amilyen a vankomicin osztályba tartozó többi antibiotikum), és ugyanazokhoz a „molekuláris receptorokhoz” kötődik, meghatározható egy megbízható, pontos, gyors és érzékeny módszerrel, amely kompetitiv vagy telítéses kötődési vizsgálatokon alapul, és amely szerint egy megfelelő szilárd fázison adszorbeáltatott D-alanil-D-alanin karboxil-terminálissal rendelkező oligopeptidet alkalmazunk egy megfelelő konjugált alakban. A D-alanil-D-alanin karboxil-terminálissal rendelkező oligopeptid lehet egy tri-, tetra-, penta-, hexa- vagy heptapeptid, míg a dipeptidet a D-alanil-D-alanin képviseli. A találmány szerinti kitüntetett D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptid az epszilon-amino-kaproil-D-alanil-D-alanin (a továbbiakban: epszilon-Aca-D-Ala-D-Ala). A D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptidet egy megfelelő hordozóval konjugáljuk annak érdekében, hogy abszorbeálhatóvá tegyük egy szilárd fázisú felületen. A megfelelő hordozó ebben az esetben bármely makromolekuláris polipeptid lehet, amely képes kovalensen kötődni a D-alanil-D-alanin karboxil-terminálissal rendelkező oligopeptidhez. Ilymódon olyan konjugátum keletkezik, amely a kiválasztott szilárd fázisú felületen képes abszorbeálódni (azaz fizikai kötéseket létrehozni). Az ilyen hordozókra kitüntetett példa az albumin, közelebbről a szarvasmarha-albumin. Használható azonban a tojás-, a humán vagy a sertés-albumin is. A szilárd fázisú felület, amelyre a D-alanil-D- alanin karboxil-terminálissal rendelkező oligopeptidet hordozó anyagot adszorbeáltatjuk, előnyösen az analitikai eszközök vagy tartályok felülete. A találmány oltalmi körébe a „hordozó vagy tároló eszköz” kifejezés bármely olyan analitikai eszközt jelent, amely folyékony reagensek tárolására alkalmas vagy legalábbis ilyeneknek kitehető. Kitüntetett példák ilyen vonatkozásban az üveg vagy műanyag mikrotitráló lemezek vagy kémcsövek vagy műanyag lapok. Kitüntetett „hordozó vagy tároló eszköz” a polietilén vagy polisztirol mikrotitráló lemezek mélyedései. Mint már mondottuk, az elemzés tárgya, vagyis az az anyag, amely a találmány szerinti módszerrel meghatározható, egy antibiotikus anyag, amely képes kötődni egy D-alanil-D-alanin dipeptidhez vagy egy D-alanil-D-alanin karboxil-terminális oligopeptidhez, amilyen a teikoplanin vagy más, a (fent meghatározott) vankomicin osztályba tartozó antibiotikum vagy annak valamely egyedi faktora, származéka, aglükonja vagy pszeudo-aglükonja. A találmány szerinti módszer kompetitiv vagy telítéses kötődési vizsgálatokon alapul. Mint ismeretes, a kompetitiv módszer abban áll, hogy a meghatározandó vegyületet kvantitatív elemzése egy ismert mennyiségű .jelzett meghatározandó vegyület” jelenlétében történik, a meghatározandó vegyület korlátozott számú „kötődési helyéért” folytatott „versengés” alapján. A telítéses módszer lényegét tekintve különbözik a versengésen alapuló módszertől, amennyiben kétlépcsős eljárást jelent. Ez abból áÚ, hogy a meghatáro5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
