194316. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-2 emberi leukocita interferon előállítására
1 194 316 2 gyógyászati készítményeket többféle rosszindulatú új képződmény kezelésére hatékonyan alkalmazzák. Ma már emberi interferonok nagytisztaságú készítményeit állítják elő. Az emberi interferon 13-15- féle, szoros rokonságban álló fehérjéből álló család, amikoris mindenegyes fehérje a saját struktúragénjén keresztül a kromoszómában kódolódik. A donor vérből történő leukocita interferon elválasztás mégsem biztosít olyan mennyiségű előállítást, amely széleskörű klinikai alkalmazásra elegendő, ugyanis 1 liter vérben általában legfeljebb 10s aktivitásegységnyi interferon található, miközben a betegek intravénás injekciózásához az előzetes klinikai megfigyelések alapján az interferon hatékony egységnyi dózisa legalább 10® aktivitási egység. Az. emberi leukocita interferonok előállítására különböző eljárások ismertek. Ezekben termelőként olyan mikroorganizmus törzseket használnak fel, amelyekbe az emberi interferonok individuális génjeit vektoriális molekulákkal viszik át. Termelőkként főleg a következő baktériumtörzsek szolgálnak: Escherichia coll, Bacillus subtilis, Methylophilus methylotrophus stb. (0062971A2) számú európai szabadalmi leírás, közzétéve 1982-ben,C 12N 15/00). Azok a mikroorganizmusok, amelyek plazmidjába az emberi leukocita interferon génjei integrálódtak, tenyésztésük során aerob szubmerz körülmények között, asszimilálható szén- és nitrogénforrást, - ásványisókat, és biosz-anyagokat tartalmazó táptalajon interferont termelnek. Ismert olyan eljárás alfa-2-emberi leukocita interferonok előállítására (2 079 29 IA angol szabadalmi leírás, közzétéve 1982-ben, C 12 N 15/00), amelyben az E. coli K-12 baktérium 294. törzsét alkalmazzák. Ezt a törzset úgy állítják elő, hogy a sejtbe juttatják a ple IFA trp 2,5 rekombinált plazmidot, amelyben az alfa-2-interferon gént az E. coli triptofán-operon szabályozó mechanizmusa ellenőrzi. A megadott törzset szubmerz körülmények között, szén-, nitrogénforrást, ásványi sókat és bioszanyagokat tartalmazó táptalajon, valamint antibiotikumjelenlétében tenyésztik. Az említett termelő törzsek esetén az interferon kitermelése 1-1 liter tenyészoldat esetén 2,5 x 10* aktivitási egység. Az E. coli baktériumnak ipari méretekben történő alkalmazásának sok hátránya van. Az E. coli feltételesen patogén mikroorganizmus. Ennek a baktériumnak különböző törzse megtalálható az ember bélflórájában. Ez a tény különleges követelményeket támaszt az E. coll-val előállított készítmények tisztításával szemben, és a fajta-idegen kísérő fehérjék és -endotoxinok tökéletes eltávolításával szemben, aminek következtében az interferon előállításának technológiája jelentősen megdrágul és a tiszta termék kitermelése lecsökken. Ezenkívül az össze» ismert E. coll törzs fagolízisnek van kitéve. Több száz E. colispecifikus fágot határoztak meg. Az említett eljárásra jellemző, hogy a kultúra termelékenysége viszonylag csekély, és így a sejtes biomasszából az interferon elválasztása és a homogén állapot érdekében az ezt követően végzett tisztítás rendkívül munkaigényes. A találmány tárgya olyan új termelő törzr előállítása, amellyel az alfa-2 emberi leukocita interferon kitermelését növelhetjük és elválasztásának technológiáját leegyszerűsíthetjük. A feladatot úgy oldjuk meg, hogy az alfa-2- emberi leukocita interferont élőálltjuk, miközben a termelő törzset, amelynek plazmidjába az alfa-2- emberi leukocita interferont gént integráltuk, süllyesztett tenyésztésnek vetjük alá. A tenyésztés szénás nitrogénforrást, ásványi sókat és bioszanyagot tartalmazó táptalajon, antibiotikum jelenlétében levegőztetés közben történik. Ezt kövefően a terméket elválasztjuk és a végterméket tisztítjuk. A találmány szerint) termelőtörzsként a pVG 3 plazmidot tartalmazó Pseudomonas VG-84 species törzset alkalmazzuk. A törzset 1742 letéti számon az összszövetségi Antibiotikum Kutató Intézet kultúragyűjteményében helyeztük letétbe. A termelő törzset antibiotikum, azaz sztreptomicin vagy tetraciklin vagy ezek keverékének jelenlétében tenyésztjük. Előnyösen a tetracikllnt 30-50 mg/1 és a sztreptomicint 50—150 mg/1 koncentrációban alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárással, az új nagytermelésű Pseudomonas VG-84 species-törzzsel nagy mennyiségű végterméket állíthatunk elő, valamint a végtermék elválasztási technológiája is leegyszerűsödik. A találmány szerinti eljárásban az új Pseudomonas VG-84 species törzset alkalmazzuk. A törzsben lévő alfa-2 emberi leukocita interferon gént a 0x174 bakteriofág D génjének szabályozó mechanizmusa ellenőrzi. A pVG3 plazmid a széles hatáskörű vektoriális pAYC 34 másoló plazmid és a pIFN-a2-P2 plazmid közti molekuláris hibrid, amely a pBR322 replikont és az alfa-2 interferon gént tartalmazza, és amely a tetraciklinnel és az ampicilinnel szembeni sejtrezisztenciát meghatározza. A pIFN-a2-P2 plazmidban az alfa-2-interferon gént a 0x174 bakteriofág D génjének szabályozóköre ellenőrzi. A pAYC34 vektorális plazmid — amely 9,4 ezer nukleotidpárból áll — a nem kompatibilis Incp-4/O csoportba tartozik, valamint meghatározza a sejt sztreptomicinnel szembeni rezisztenciáját. A pAYC34 DNS-t és a pIFN-a2-P2 plazmidot a Pstl restrikciós enzimmel kezeltük, és az E. coll C 600 törzs kompetens sejtjeit az összeötvözött eleggyel transzformáltuk. A transzformált sejteket ampicillin (50 /ag/ml), sztreptomicin (100 /ig/ml) és tetraciklin antibiotikumokat (25 jag/ml) tartalmazó táptalajra helyeztük. A transzformált kiónokban a pVG3-nak nevezett plazmid-DNS-t mutattuk ld, amely a nagyság és a restrikciós térkép alapján a pAYC34 és a pIFN-a2-P2 plazmidok közti hibrid. A pVG3 plazmid az antibiotikumokkal szembeni sejtrezisztenciát határozza meg, így a PAYC 34 a sztreptomicinnel szemben, és a pIFN-a2-P2 a tetraciklinnel és az amp- Hcinnel szemben. A pVG3 plazmid nagysága 14,8 ezer nukleotid pár, megegyezik a pIFN-a2-P2 plazmid (5,4 ezer nukleotidpár) és a pAYC34 plazmid (9,4 ezer nukleotidpár) együttes nagyságával. A pVG3 hibridplazmidot tartalmazó E. coli C600 törzsbe juttattuk az R 751 konjugatív, széles hatáskörű plazmidot. Több konjugatív kereszteződéssel pVG3 plazmidot juttattunk Pseudomonas baktériumokba és egyéb Gram-negatív baktériumokba. A transzkonjugált baktériumokat a már megadott antibiotikumot tartalmazó szelektív közegre helyeztük és az interferon szintézisének képességét vizsgáltuk. Az itt leírt eljárással előállított kultúrákat aerob 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
