194316. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-2 emberi leukocita interferon előállítására
1 körülmények között, 30°C hőmérsékleten L-Bouillon-on (Manlatis I., Frits E., Sembrook D.: MolekuráUs klónozás, Moszkva (1984) 390.) 6-10 óra alatt addig tenyésztettük, amíg a baktériumliter 2-5 x 109/1 ml lett. A baktériumokat centrifugálással összegyűjtöttük, ultrahanggal felapróztuk és a sejtextraktumok interferontartalmát radioimmunológial eljárással meghatároztuk. Az Escherichia, a Salmonella, a Pseudomonas, a Methylomonas, az Erwinia és a rhizobium osztály Gram-negatív baktériumaiból 18 törzset vizsgáltunk. A vizsgált törzsek többsége az aktív interferont termelte. A legnagyobb termelési aktivitást a Pseudomonas VG-84 sp. törzs mutatta. Ez a törzs a megadott körülmények között 1 liter tenyészoldatban 5 x 109 — 1 x 10*° aktivitás egységnyi interferont termelt. A VG-84 Pseudomonas sp. törzset az Össz-szövetségi Antibiotikum Kutatóintézet kultúra gyűjteményében 1742 deponálási számon helyeztük letétbe. A pVG3 plazmiddal rendelkező Pseudomonas VG-84 sp. törzs tenyészet-morfológiai jellemzése a következő: morfológia mik- gram-negatív, 3-5 pm hosszú mozroszkópban gékony pálcikák morfológia különböző közegben: hús-pepton-agar 24 órás, 25—30°C hőmérsékleten folytatott tenyésztés után egyenetlen szélű, 3—4 mm átmérőjű, durva felületű, halványzöld színű kolóniák képződnek, hús-pepton- főleg a közeg közepén megflgyelhúsleves hető mérsékelt növekedés. A növekedés levegőztetés nélkül gyenge, glükóztartalmú Két elteltével 2—3 mm átmérőjű, M9 minimál szürke, kerek és durva felületű -közeg kolóniák képződnek. (Manlatis I., Frits E., Sembrook D.: Molekuláris klónozás (Moszkva, 1984)350.0.) fiziológiai és bio- 25-35°C, optimálisan 30°C hőkémiai jellem- mérsékleten, pH = 7,0-on szapozők rodnak, szénforrás: hasznosítja a glükózt és arabinózt nitrogénforrás: jól asszimilál. Adenin igénye van. Sztreptomicinnel és tetraciklinnel szemben stabil. A találmány tárgy szerinti eljárást a következőképpen folytatjuk le. A Pseudomonas VG-84 sp. törzset agar táptalajon, 28-30°C hőmérsékleten, 8-12 óra alatt tenyésztjük, ezután folyékony táptalajra átoltjuk, és az Inokulumot erőteljes kevertetés és levegőztetés közben 3-6 óra alatt, 28°C hőmérsékleten tenyésztjük. A fermentációt tetszés szerinti szén-, nitrogénforrást, ásványi sókat és biosz-anyagot tartalmazó tápoldaton, például glükózt, élesztő-extraktumot vagy -autolizátumot vagy triptont vagy peptont vagy kazeinhidroUzátumot vagy ezeknek a keverékét tartalmazó táptalajon folytatjuk le. A fermentáció sztreptomlcin vagy tetraciklin vagy ezeknek az antibiotikumoknak a keverékének a jelenlétébéh történik. Előnyösen 30-50 mg/1 tetraclklint és 50-150 mgA sztreptomicint alkalmazunk. A fermentáció 28-32*0 2 hőmérsékleten, 6,7—7,1 pH értéken, alapos átlevegőztetéssel, 6-10 óra alatt zajlik le. A folyamat során megmérjük a baktériumszuszpenzió A55o optikai sűrűségét, amikoris a fermentáció végére az optikai sűrűség az 5-7 egységet éri el. A megadott tenyésztési körülmények között, a megadott radioimmunológiai elemzések adatai alapján, vagy az emberi fibroplaszt kultúrán mért vírusölő hatás alapján az interferon kitermelés 1 liter tenyészoldatban 5 x 109 — l,5x 10í0 aktivitási egység. A megadott optikai sűrűség elérése után a fermentációs folyamatot befejezzük, majd a baktériumsejteket centrifugálással összegyűjtjük, a megfelelő pufferban reszuszpendáljuk és ultrahang kezeléssel vagy olyan eljárással, amely a sejtet széttöri, vagy amely a sejthám épségét megbontja, így például lizozimes kezeléssel, üveg- vagy fémgolyóval végzett ballisztikus módszerrel, French-prés alkalmazásával — szétzúzzuk a sejteket. A sejtdarabokat centrifugálással elválasztjuk, és a felülúszóból (a sejtextraktumból) ismert fehérjefrakcionálási és -tisztítási eljárásokkal az interferont izoláljuk. A különböző fizikai és kémiai kritériumok szerint előállított homogén, 200-500-szoros tisztaságú interferon kitermelése 20-60%, és a tisztítással előállított végtermék specifikus aktivitási egysége 4 x 10*. A tisztítási folyamatra oly módon ügyeltünk, hogy az interferon aktivitását emberi fibroplaszt kultúrán radioimmunológiai vagy immunferment analízissel és a vesicularis stomatitis vírus alkalmazásával meghatároztuk (Kosztrov S. W.: „Emberi leukocita interferon ^összehasonlító immunológiai elemzése, „Biochemie”, 50, 12. sz., 2031-2039, 1985.) A tisztítással előállított interferon készítmény tisztaságát immun-, elektroforézises-, gél-szűréses- és szedimentációs eljárással, valamint az elválasztott végtermék aminosavösszetevőinek és az N-terminális aminosavszekvenciának meghatározásával ellenőriztük. Az előállított alfa-2-emberi leukocita interferon homogén készítményeinek több olyan struktúrafunkcionális jellemzője van, amely ezeknek az interferon típusoknak a sajátja. A találmány szerinti eljárásnak az ismert eljárásokkal szemben tapasztalt előnye, hogy új, nagy termelőképességű törzs alkalmazásával nagy hatékonyságú fermentációt lehet megvalósítani, és így ugyanazt az interferonmennyiséget kevesebb térfogatú biomasszából lehet előállítani és ezáltal csökken a biomassza elválasztási költsége, és a homogén készítmény előállításához szükséges összes, későbbi munkafolyamatra kedvező hatással van. Az Edmann-féle automatikus szekvencia-analízis adatai alapján a Pseudomonas VG-84 sp. termelőtörzs biomasszájából izolált homogén 1 iterferon N- terminális amlnosavszekvenciája: Cys-Asp-Leu-Pro-Glu-Thr-His-Ser ... és az N-végen nem tartalmaz metionln-csoportot, ezáltal szerkezetileg teljesen megegyezik az emberi leukocitákkal előállítható alfa-2-interferonnal. A jelen találmány jobb megértése érdekében az alfa-2-emberi leukocita interferon előállításához szolgáló eljárást a következő példákkal szemléltetjük: 194 316 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
