194310. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új TAN-588 antibiotikum alkálifém-, alkáliföldfém-, ammóniumsójának és N-dezacetilezett-származékának előállítására
1 194 310 2 nizmus is van, nagyobb mennyiségben eredményezi az N-dezacetilezett TAN-588-at, mint a csak Empedobacter vagy Lysobacter mikroorganizmus tenyészet. A TAN-588 antibiotikum alkálifém- alkálföldfém-, vagy ammóniumsóját és/vagy N-dezacetilezett származékát a tenyészetből jól ismert módszerekkel nyerhetjük ki. Mivel a TAN-588 és/vagy N-dezacetilezett származéka vizoldható és ezért főtömegben a fermentlé szürletében van, célszerűen úgy járunk el, hogy a folyékony tenyészethez először egy szűrést elősegítő anyagot adunk, ami elősegíti a szűrésnél vagy a centrifugálásnál a mikrosejtek eltávolítását, majd ezután a szürletet egy, az aktív anyagot adszorbeálni képes hordozóval érintkeztetjük, amiről azután az aktív anyagot egy megfelelő oldószer segítségével eltávolítjuk. Hordozóként használhatunk olyan anyagokat, amelyek a vegyületeket különböző mértékben adszorbeálják, mint például aktívszenet, szilikagélt, kristályos cellulózt, vagy amelyek a vegyületek funkciós csoportjait különböző mértékben kötik meg, mint például anioncserélő műgyantákat, és anioncserélő cellulózt, vagy olyan anyagokat, amelyek a molekulaméret szerinti elkülönítést teszik lehetővé, mint például gélszűrésnél alkalmazott közeget. Eluálószerként használhatjuk például vízzel elegyedő oldószerek vizes oldatait, mint például vizes aceton vagy alkoholok vizes oldatát, vagy lúgokat, puffereket, szervetlen vagy szerves sókat tartalmazó vizes oldatokat, vagy ezek megfelelő kombinációit. A fenti módszerek valamelyikével kinyert nyers antibiotikumot nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel tisztíthatjuk tovább. Egy másik megoldás szerint az aktívszénről eluált sótalanított oldatot koncentráljuk és a koncentrátumból íonpár extrakciós módszerre], mint például kvaterner alkilammónium-halogenidet tartalmazó szerves oldószert alkalmazva, nyerjük ki az antibiotikumot. Előnyösen járunk el például, ha a savas tulajdonságú TAN-588-at egy anioncserélő gyantával, mint például Dowex-I gyantával (gyártó cég: Dow Chemical Co., USA), Amberlíte IRA-68,400,402 és 410 gyantával (gyártócég: Rhom and Haas, USA) vagy Diaion SA-21 és C gyantával (gyártó cég: Mitsubishi Czemical Industries, Japán) a szürletből adszorbeáljuk és onnan például sókat, savakat vagy puffereket tartalmazó vizes oldatokkal eluáljuk. Ugyanígy az antibiotikumot adszorbeáltathatjuk például egy anioncserélő cellulózon, mint például DE-32 (gyártó cég: Whatman Co., Nagy-Britannia) vagy DEAECellulose-on (gyártó cég: Braun Co., nszk), vagy egy anioncserélő molekulaszitán, mint például DEAE vagy OAE-Sephadex (gyártó cég: Pharmacia, Svédország), és onnan sókat, savakat vagy puffereket tartalmazó vizes oldatokkal eluáljuk. Az eluátumokból a sók és a színezőanyagok eltávolítását kromatográfis célokra készült aktívszénnel, mint például a Takeda Chemical Industries, Ltd., Japán által forgalomba hozott aktívszén, vagy adszorpciós gyanták, mint például Diaion HP-20 vagy SP-207 gyanta (gyártó cég: Mitsubishi Chemical Industries, Jaoán) vagy Amberlit XAD-II gyanta (gyártó cég: Rohm and Haas Co., USA) alkalmazásával végezhetjük. Az eluált frakciót különböző, egymást követő műveletekkel, mint például koncentrálás, liofilizálás, stb. porrá alakítjuk. A kapott port szükség szerint tovább tisztíthatjuk, előnyösen preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás módszenei. Ehhez a tisztítási művelethez különböző hordozóanyagokat, mint például TSK Gél (gyártó cég: Toyo Soda Kfg. Co., Japán) vagy YMC Gél (gyártó cég: Yamamura Chemical Laboratories, Japán) használhatunk. Mozgófázisként metanol, acetonitril, stb. és vizes savas oldatok vagy pufferek elegyeit használhatjuk. Az ionpár extrakciós módszernél kvaterner alkil-ammónium-halogenidként használhatunk például tri-n-oktil-metil-ammónium-kloridot, tetra-n-pentil-ammónium-kloridot vagy n-tetradecil-dimetil-benzil-ammónium-kloridot, míg szerves oldószerként a szokásosan alkalmazott oldószereket mint például, metilén-ldoridot, kloroformot vagy diklór-etánt használhatunk. Az amfoter tulajdonságú N-dezacetilezett TAN- 588 a szürletből kationcserélő gyantával, mint például Dowex 50W gyantával (gyártó cég: Dow Chemical Co., USA) és Amberlite IR-120B gyantával (gyártó cég. Rohm and Haas, USA) adszorbeáltatható, és onnan sókat, savakat vagy lúgokat tartalmazó vizes oldatokkal vagy pufferekkel eluálható. A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumot kationcserélő molekula szitákkal is adszorbeálhatjuk. Ilyen például a CM-Sephadex (gyártó cég: Pharmacia, Svédország) márkanemű molekulaszita. Az adszorbeált antibiotikumot a molekulaszitáról sótartalmú vizes oldatokkal vagy pufferekkel eluálhatjuk. Az eluátumokból a sók, színezőanyagok eltávolítását kromatográfiás célokra készült aktívszénnel, mint például Diaion SP-207 vagy HP-20 márkanevű aktívszénnel végezhetjük. Az összegyűjtött eluátumokat koncentráljuk, majd liofizáljuk, A kapott poralakú terméket szükség szerint tovább tisztíthatjuk, előnyösen preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel. A folyadékkromatográfiás tisztításnál hordozóanyagként és mozgófázisként a TAN-588 antibiotikum tisztításnál fent ismertetett anyagokat használhatjuk. A tisztítás olyamán a TAN-588 az alkalmazott sókból vagy pufferekből a kationokkal, mint például kálium-, nátrium-, lítium-, kálcium- vagy ammóniumionokkal a megfelelő sóvá alakul, és aktívszénen kromatografálva só formában nyerhető ki. Ha az eluátum pH-ját 5—2, előnyösen 4,5—3 közé állítjuk be, akkor az aktívszénen történő kromatografálás után a TAN-588-t szabad sav formában nyerjük ki. Az N-dezacetilezett TAN-588-t amfoter formában kapjuk meg az aktívszenes kromatografálás után semleges eluálószert használva. Mivel az N-dezacetilezett TAN-588 amfoter sajátossága mellett bázikus tulajdonságú, erős savakkal sót képez. Ilyen savak például a sósav, foszforsav és trifluor-ecetsav. Az ily módon kapott TAN-588 alkálifém-, alkáliföldém- vagy ammóniumsója a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatografálás során két csúcsot mutat. Ezeket a csúcsokat A és B Jelöléssel láttuk el és magyarázatukat a következőkben adjuk meg. A folyadékkromatografálás során kapott A és B csúcsoknak megfelelő frakciókat külön-külön kigyűjtve a TAN-588 A típust és TAN-588 B típust tiszta egyedüli formában kapjuk meg. Ha ezeket a frakciókat 3, 5 és 7 pH-jú pufferekben, szobahőmérsékleten állni hagyjuk, azt tapasztaljuk, hogy körülbelül másfél óra múlva a pH értéktől függetlenül az A és B frakciók egymásba alakulnak és így az A és B egyen-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
