194309. lajstromszámú szabadalom • Expressziós vektorok
1 194 309 2 8. ábra EcoRl és Clal restrikciós hasítási helyek kialakítása különböző leolvasási fázisban a pERIII-8rl plazmidban. A pERIlI-8pl plazmid polilinker régiójának nukleotid szekvenciája és a kódolt aminosavak a fölső sorban láthatók. Ebből Xbal és EcoRl enzimekkel végzett restrikciós emésztés (a), a végek tompa végekké kiegészítése DNS polimeráz Klenow szubfragmentummal (0) és T4 polinukleotid ligázzal történő összekapcsolásuk után {7) nyertük az alsó sorban bemutatott pERIII-8rl plazmidot, amelyben az EcoRl hasítási hely 1. és Clal pedig 2. leolvasási fázisban van. 9. ábra EcoRl és Clal restrikciós hasítási helyek kialakítása különböző leolvasási fázisban a pERIII-8r3 plazmidban. A felső sor a pERIII-8sp plazmid polilinker régiójának nukleotid sorrendje és a kódolt aminosavak. Az ebből Xbal és BamHI restrikciós endonukleázokkel végzett emésztéssel (a) éa végek tompa végekké alakításával (0) és összekapcsolásával T4 polinukleotid ligázzal (7) kialakított pERI!I-8r3 plazmádban a Clal hasítási hely 1., az EcoRl pedig 3. leolvasási fázisban van. A restrikciós endonukleázok hasítási helyeit aláhúzásokkal jelöltük. 10. ábra Clal restrikciós endonukleáz hasítási hely kialakítása 3. leolvasási fázisban a pERIlI-8r0 plazmid ban. A pERIII-8rl plazmidot EcoRl restrikciós endonukleázzal hasítottuk (a), a végeket DNS polimeráz Klenow szubfragmentummal tompa végekké alakítottuk (0), majd T4 polinukleotid ligázzal összekapcsoltuk a molekulát. Az így előállított pERIII-8r0. plazmid polilinker régiójában a Call hasítási hely az előbbihez képest egy nukleotiddal el van csúsztatva. 11. ábra EcoRl és Clal restrikciós hasítási helyek kialakítása különböző leolvasási fázisban a pERIII-8r2 plazmidban. A pERIII-8pI plazmidot a polilinker régióban BglII és BamHI restrikciós enzimekkel hasítotuk (a), a végeket tompa végekké alakítottuk (0), majd polinukleotid ligázzal összekapcsoltuk a plazmidot (7). Az így kialakított polilinker régióban a Clal hely 1., az EcoRl 2. leolvasási fázisban van. 12. ábra A pERIII-8 plazmidok általános szerkezete kiemelve a HindlII-HindlII hasítási helyek közötti polilinker régiókat. A nukleotid szekvenciában bekereteztük a felírt restrikciós enzimek felismerési helyeit és a szekvencia fölött megjelöltük és alfa-peptidnek megfelelő leolvasási fázist. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás expressziós vektor konstruálására, azzal jellemezve, hogy az E. coli riboszomális operonját (rrn operon) egy hordozó vektorba építjük, majd a hordozó vektorba beépített rrn operon sttruktúragénjeinek jelentős részét eltávolítjuk, vagy a hordozó vektorba beépített rrn operon vagy annak deléciókkal rövidített származéka mellé egy fehérjét szintetizáló oepron alkalmas részét építjük be, és kívánt esetben a létrehozott szabályozó részbe beépítjük a kifejezni kívánt struktűragént. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett rRNS-eknek megfelelő szekvenciákon belül végződő deléciót tartalmazó rrn operont használunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozó vektorként pBR322 plazmidot alkalmazunk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pBR hordozó vektor nem esszenciális (max. 4250-4363-ig és 4363-2450-ig) régióit emésztési lépésekkel eltávolítjuk. 5. Az 1-4. igénypontok szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a hibrid szabályozó régiót az rrn és a lac operon részeiből hozzuk létre és a különböző eredetű részek között deléciókat kialakítva vektorsorozatot képzünk, amelyből célszerűen a magas lac aktivitást mutató konstrukciókat emeljük ki. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy BAL31 nukleázzal végzett emésztéssel legföljebb olyan nagyságú deléciókat alakítunk ki, amelyekkel hibrid promotert hozunk létre az rrn és a lac operon promotereinek részleteiből. 7. Az 1-6. igénypontok szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a lac eredetű rész végére az idegen gén inszertálására alkalmas polilinker fragmentumot építünk. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás pERIII-8 plazmid (MNG00302), amely tartalmazza a pBR322 plazmid 2068-tól 4278 bp-ig terjedő részét, ami ainpicillin rezisztenciát és Col El típusú replikádét biztosít: tartalmazza az rrnB operon első részét a -294-től —189 bp-ig, valamint 78-tól 270 bp-ig, ami összekapcsolva a lac operon -14-től +243 bp-ig terjedő részével hibrid szabályozó régiót képez és a bétagalaktozidáz N terminális 70 aminosavát kódolja; tartalmazza az rrnB operon terminátor régióját a 4965- tól 5508 bp-ig, ez a lac operon végéhez és a pBR rész 2068-ik nukleotidjához kapcsolódik — ahol a számozásban a 16S rRNS génben az érett 16S rRNS első nukleotidjának megfelelő pontot tekintjük a +1 pontnak, a lac régióban ugyanez a lac mRNS első nukleotidja - és a plazmidot a HindlII enzim egy helyen, a lac operon eredetű rész vége és az rrnB terminátor régió között hasítja, előállítására, azzal jellemezve, hogy rrnB riboszomális RNS operont izolálunk \riP18 bakteriofág DNS-ből, a Xrif°18 DNS 7,5 kb-s fragmentumát pBR322 plazmid BamHI hasítási helyére építjük be, a pBB9 plazmidot alakítva ki, ezt Hpal-gyel hasítjuk, és az így kialakult lineáris molekulát BAL31 nukleázzal részlegesen emésztjük, a rövidített lineáris plazmidok keverékét T4 polinukleotid ligázzal ligáivá cirularizáljuk, a ligálási keveréket E. coli HB10I sejtekbe transzformáljuk, a transzformánsokből plazmidokat izolálunk, és restrikciós enzimes elemzés alapján a lerövidített operonnal rendelkező plazmidokat kiválasztjuk, és ezek közül a 2. ábra szerinti pBB9A9 plazmidot izoláljuk, ezt a plazmidot Sáli-gyei hasítva linearizáljuk, a lineáris plazmidot BAL31 nukleázzal részlegesen emésztve mintegy 1600 nukleotiddal rövidítjük, az így létrejött terméket PvuII-vel emésztjük, majd recirkularizáljuk, és az így keletkezett plazmidok közül a pBB9-b28 plazmidot kiválasztjuk, ezt a plazmidot EcoRI-gyel és FspII-vel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompává alakítjuk és a végeket összekapcsolva cirkularizáljuk, és a keletkezett plazmi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
