194309. lajstromszámú szabadalom • Expressziós vektorok
1 194 309 2 dók közül a p408-5 plazmidot izoláljuk, ezt a plazmidot FspII-vel és részlegesen BAL31-gyel kezeljük, és a különböző mértékű deléciókon átment plazmidok közül BspRl-gyel, Mspl-gyel és Hhal-gyel végzett térképezés alapján a 6a. ábra szerinti p419-10 plazmidot kiválasztjuk, ezt Stul-gyel hasítjuk, a hasított termék végeihez EcoRl linkért kapcsolunk, az így kapott terméket EcoRI-gyel emésztjük, és az így kapott DNS-t cirkularizáljuk, és a 6b. ábra szerinti p808-2 plazmidot izoláljuk, ezt EcoRI-gyel és HindlII-mal hasítjuk, és a hasítási termékhez pLBU3 plazmid 412 bp-s HindlII-EcoRI fragmenseit ligáljuk, a ligátummal E. coli sejteket transzformálunk, a transzformánsokból plazmidokat izolálunk, a plazmidok közül restrikciós enzimes emésztés alapján a 6c. ábra szerinti p827-10 plazmidot izoláljuk, ezt EcoRl emésztéssel linearizáljuk, majd maximum 400 bp-t BAL31 nukleázzal eltávolítunk, a plazmidot ligázzal körré zárjuk, és az a-peptid szintézis, valamint restrikciós enzimes emésztés alapján a pERIII-8 plazmidot (MNGOO302) kiválasztjuk. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás a) pERIII-8rl plazmid (MNGOO303) - amely a pERIII-8 plazmid inszerciós származéka, a HindlII hasítási helyen 40 nukleotid hosszúságii inszertet tartalmaz, utóbbin HindlII és EcoRl hasítási hely van 1-es, Clal 2-es és Xbal valamint PvuII 3-as leolvasási fázisban_ b) pERII-8r3 plazmid (MNGOO304) — amely a pERIII-8 plazmid inszerciós származéka, a HindlII hasítási helyen 54 nukleotid hosszúságú inszertet tartalmaz, utóbbin HindlII, Clal és BamHI hasítási hely van 1-es és EcoRl, valamint PvuII 3-as leolvasási fázisban -, c) pERIII-8r0 plazmid (MNGoo305) — amely a pERIII-8 plazmid inszerciós származéka, a HindlII hasítási helyen 44 nukleotid hosszúságú inszertet tartalmaz, utóbbin HindlII hasítási hely van 1-es, Xbal, Clal és PvuII hasítási hely van 3-as levolvasási fázisban d) pERIII-8r2 plazmid (MNGOO306) — amely a pERIII-8 plazmid inszerciós származéka, a HindlII hasítási helyen 59 nukleotid hosszúságú inszertet tar- 5 talmaz, utóbbin HindlII és Clal hasítási hely van 1-es, EcoRl 2-es és Xbal, valamint PvuII 3-as leolvasási fázisban -, előállítására, azzal jellemezve, hogypHC314 plazmidot (MNGOO280) EcoRI-gyel emésztjük, újra ligáljuk, a ligátumot E. coliba transzformáljuk, a 10 transzformánsokból plazmidokat izolálunk, és a plazmidok közül két vx-eredetű polilinkert azonos orientációban tartalmazó fragmentummal rendelkező plazmidot kiválasztjuk és ezt HindlII-mal emésztjük, és a 110 bp-os polilinker fragmentumot izoláljuk, . _ és ezt a fragmentumot HindlII-mal linearizált pERIII-8 ' * plazmidba ligáljuk, így alakítjuk ki a pERIII-8pl plazmidot, és 1) a pERIII-8rl plazmid előállítására a pERIII-8pI plazmidot Xbal-gyel és EcoRI-gyel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé emésztjük, a 2Q végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé tesszük, és T4 polinukieotid ligázzal cirkularizáljuk, és a pERIII-8rl plazmidot (MNG000303) izoláljuk, vagy 2) a pERIII-8r3 plazmid előállítására a pERIII-8pl plazmidot Xbal-gyel és BamHI-gyel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé tesszük és 25 T4 polinukieotid ligázzal cirkularizáljuk, és a pERIII- 8r3 plazmidot (MNGOO304) izoláljuk, vagy 3) a pERIII-8rO plazmid előállítására a pERIII-8pl plazmidot EcoRI-gyel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé tesszük, és T4 polinukieotid ligázzal cirkularizáljuk, és a pERIII-8r0 plazmidot 30 (MNG00305) izoláljuk, vagy . 4) a pERIII-8r2 plazmid előállítására a pERIII-8pl plazmidot BglII-vel és BamHI-gyel emésztjük, a végeket Klenow-fragmenssel tompa végűvé tesszük, és T4 polinukieotid ligázzal cirkularizáljuk, és a pERIII-8r2 plazmidot (MNG00305) izoláljuk. 10 db rajz Kiadja: Országos Találmányi Hivatal relelős kiadó: Himer Zoltán KÓDEX 8
