194309. lajstromszámú szabadalom • Expressziós vektorok
1 194 309 2 nukleotiddal van a vége. A vektorból az ampicillin gén előtt az egyik plazmidból 82, a másikból 110 nukleotidot távolított el a deléció. A pBR322 és rrnB eredetű rész csatlakozási pontjának környezetében a nukleotid szekvenciát a 3. ábra tartalmazza. A lerövidített rrnB operont összekapcsoltuk az E. coli lac operon első részével. Ezt egy 412 bp hoszszúságű HindlII és EcoRI restrikciós endonukleázok hasításával képződő fragmentumként izoláltuk a pLBU3 plazmidból [Gentz, R., Langer, A., Chang, A. C. Y., Cohen, S. N. and Bujard, H. (1981) Cloning and analysis of strong promoters is made possible by the downstream placement of a RNA termination signal. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 4936— 40.]. Az izolált fragmentum az EcoRI vég felől a HindlII hely felé haladva a következő részeket tartalmazza: 160 bp ismeretlen eredetű és funkciójú DNS, ami a lac promoter Pribnow-box előtt négy nukleotiddal kapcsolódik a lac operonból származó részhez. Ez utóbbi 240 bp a lac promoter egy része (-10-es régió), a teljes operátor, a mRNS,miciáció helye, a riboszóma kötőhely az mRNS 5 -végének megfelelő részen, az ATG transzláció start szignál és a /3-galaktozidáz első hetven aminosavát kódoló rész. A fragmentumon kódolt N-terminális polipeptidnek (a-peptid) önmagában nincs ß-galaktozidáz aktivitása, bizonyos típusú, hibás ß-galaktozidáz molekulákkal — amelyek önmagukban szintén inaktívak — kölcsönhatva azonban képes részlegesen helyreállítani a funkcióképes enzimet (aakceptor mutánsok). A p419-10 píazmidot a P2 promoter és Ti terminátor között, a Stul restrikciós endonukleázzal hasítottuk és a lineáris plazmid molekulák tompa végeihez EcoRI linkért kapcsoltunk. A linker-plazmid DNS ligáit elegyét EcoRI enzimmel emésztettük és a plazmid molekulák cirkularizációját elősegítő reakciókörülményeket használva, újra ligáltuk a DNS-t. A transzformáció után izolált p808-2 jelzésű plazmid csupán annyiban tér el a kiindulási plazmidtól, hogy hiányzik belőle a Stul hasítási hely és annak helyén a linker beépítésével egy EcoRI helyet képeztünk (6. ábra). A plB43-ból izolált fragmentumot az EcoRI és HindlII enzimekkel hasított p808-2 plazmid DNS-sel összekapcsoltuk és a ligátummal E. coli sejteket transzformáltunk. A transzformáit sejtekből az indikátort tartalmazó táptalaj felületén 24-36 óra alatt halvénykék baktérium kolónák nőttek ki, jelezve, hogy alacsony szintű a-peptid expresszió van. Ezekből plazmid DNS-t izoláltunk és restrikciós enzimekkel végzett térképezéssel igazoltuk, hogy a p827-10 (MNG-00307) jelzésű píazmidot tartalmazzák (6. ábra), ami a két fragmentum megfelelő összeépülésével jött létre. A következő fázisban deléciókat hoztunk létre az rrnb eredetű promoter és a transzlációs startpont között a transzlációs efficiencia növelése céljából. A p827-10 píazmidot EcoRI emésztéssel linearizáltuk, majd bAL31 nukleáz'emésztéssel legfeljebb 400 bpig különböző hosszúságú szakaszt eltávolítottunk és a píazmidot ligázzal újra körré zártuk. Az így létrejött különböző konstrukciók közül azokat választottuk ki, amelyek indikátorlemezen intenzív ó-pepiid szintézist mutattak. Az így keletkezett plazmidok egyikében a pERIII-8 plazmidban (MNG 00302) az rrnB promoter egyik fele (az ún. —35 régió) optimális távolságban kapcsolódik a lac promoter másik felélvez (ún. —10 régió, vagy Pribnow-box) és tökéletes hibrid-promotert hoz létre — „rác” promoter - amelyet optimális távolságban követ a transzlációs starthely, közöttük a szabályozhatóságot biztosító lac operátorral. (7. ábra). Más létrejött konstrukciókban a rrnB és lac eredetű részek különböző pontokon kapcsolódnak. Az előbbi pontokban tárgyalt konstrukció, a pERIII-8 plazmid már csaknem minden követelménynek megfelel. Lényeges hátránya azonban, hogy idegen gén befogadására csak korlátozott le he. tőségeket nyújt. Ezt az o-peptidet kódoló régiókban, illetve az annak a végén elhelyezkedő PvuII, illetve HindlII hasítási helyek teszik lehetővé. A következő átalakítások célja az volt, hogy lehetővé tegyük idegen gének beépítését a legáltalánosabban használt restrikciós endonukleázokkal, mindhárom lehetséges leolvasási fázisban. E célból a pERIII-8 píazmidot az ítpepiidet kódoló rész végén levő HindlII hasítási helyen felnyitottuk és beépítettük egy 110 bp hosszúságú ún. polilinker fragmentumot, amelyet a következő úton állítottunk elő: A pHC314 píazmidot (MNG 00280) — és a 77 vp plazmidok részeiből lett összeépítve 1/35280 közzétételi számú magyar szabadalmi bejelentés) — EcoRI enzimmel emésztettük és újra ligáltuk, transzformáltuk. A nyert ampicillin rezisztens balí' térium klónokból píazmidot izoláltunk és kiválasztottuk azokat, amelyekbe kétszer épült be a vx eredetű polilinker fragmentum. Ezek közül kiválasztottunk egy olyat, amelyben a két polilinker azonos orientációban (fej-fej) kapcsolódik és ebből HindlII enzimmel emésztve izoláltuk a 110 bp hosszúságú, fragmentumot. Ez a polilinker EcoRI, BamHI, PstI, BglII, Clal és Xbal restrikciós hasítási helyeket tartalmaz és könnyen beépíthető a pERIII-8 plazmid HindlII hasítási helyére. Ebből a konstrukcióból további átalakításokkal négy olyan plaznüdot nyertünk, amelyek mindhárom lehetséges leolvasási fázisban tartalmazzák a Clal és EcoRI helyeket és ezeken kívül két leolvasási fázisban tartalmazzák a Clal és EcoRI helyeket és ezeken kívül két leolvasási fázisban a BamHI helyet és egyben a HindlII, Xbal és BglII helyeket. E konstrukciók leírásához célszerű definiálni a leolvasási fázist. Mivel a szóbanforgó restrikciós enzimek felismerő helye hat bázispár (azaz, két kódtriplet), a követkézőkben 1. fázisnak azt nevezzük, ahol a felismerőhely első bázispáija megegyezik egy kódtriplet első bázispáijával, 2. fázisban a kódtriplet középső, 2. fázisban pedig a kódtriplet utolsó bázispárjával. A polilinker továbbalakításait a különböző leolvasási fázisban elhelyezkedő hasítási helyek kialakítására a 8., 9., 10. 11. ábrák tartalmazzák. A felsorolt plazmidok a következő egyedi hasítási helyeket tartalmazzák olyan formában, hogy segítségükkel idegen fehérjét kódoló DNS szakasz egyszerűen kapcsolható a jjgalaktozidáz N-terminális részét kódoló DNS darabhoz: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
