194309. lajstromszámú szabadalom • Expressziós vektorok
1 Plazmid 1. fázis 2. fázis 3. fázis pERIII-8pl HindlII BglII Xbal (kiindulási) EcoRI GamHI PvuII Clal pERIIl-8 rl HindlII Clal Xbal (MNG 00303) EcoRI PvuII pERIH-8r3 HindlII — EcoRI (MNG 00304) BamHI PvuII Clal pERIII-8 rO HindlII — Xbal (MNG 00305) Clal PvuII pERIII-8r2 HindlII EcoRI Xbal (MNG 00306) Clal PvuII Az alábbiakban ismertetjük a kísérletekben felhasznált anyagokat és módszereket. Vegyszerek és prepepardtumok Az általános használt laboratóriumi vegyszerek alt. minőségű, kereskedelmi forgalomban beszerezhető, REANAL, SIGMA és MERCK készítmények voltak. A [y32P]ATP és [Or3 2 PjdATP preparátumok (Magyar Izotóp Intézet, Budapest) specifikus aktivitása 100-150 TBq/mMvolt. A használt BamHI, HapI, Sáli, PvuII, EcoRI, BspRI, Mspl, HindlII, PstI, BglII, Xbal, FspII restrikciós endonukleázokat az MTA, SzBK Biokémiai Intézet Nukleinsav csoportjának munkatársai tisztították a közölt módszerek alapján (RJ. Roberts, 1983), a Clal, Stul, Hhal enzimek pedig New England BioLabs készítményei voltak. A BAL 31 nukleáz és Klenow-enzim (E. coli DNA-polimerasI Large Fragment) New England Biolabs, a bakteriális alkalikus foszfatáz (BÀP) Worthington a pankreász RN-áz és lizozim pedig REANAL készítmény volt. A T4 indukált polinukleotid ligázt Murray eljárásával tisztítottuk úMurray, N. E. Bruce, S. A. and Murray, K.: Molecular cloning of the- DNA ligase gene from bacteriphage T4 J. Mol. Biol. 132 (1979)493-505.), Törzsek Escherichia coli HB101 (pro', leu’, thi’, lac’, strR, r’, m’, endof, recA": Boyer, H. W., Roulland-Dussoix, D. (1969) A complementation analysis of the restriction and modification of DNA in E. coli. J. Mol. Biol. 41, 459-472.) MNG 00290 Escherichia coli ED8800 (supE, supF, hsdS-, met-, lacZM15, recA56: Murray, N. E., Brammar, W. J. and Murray, K. (1977) Lambdoid phages that simplify teh recovery of in vitro recombinants. Mol. gen. Genet. 150, 53-61. MNG 00291. 'yriil 8 [Kirschbaum, J. B. and Konrad, E. B. (1973) Isolation of a specialized lambda transducing bacteriophage carrying the beta subunit gene for Escherichia coli. ribonucleic acid polymerase. J. Bacteriol. 116, 517-526.]. pBR322 [Bolivar, F., Rodriguez, R. L., Green, P. J., Betlach, M., Heyneker, H. L., Boyer, H. W. Crosa, J. and Falkow, S. (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles. Gene 2, 95-113.] pLBU3 [Gentz, R., Langer A., Chang, A. C. Y., Cohen, S. N. and Bujard, H. (1981) Cloning and analysis of strong promoters is made possible by the 2 downstream placement of a RNA termination signal. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 4936-40.] pHC314 [Boros, I., Postfai, Gy., Venetianer, P. (1984) Eljárás nagy kópiaszámú plazmid vektorok előállítására, T/35280 közzétételi magyar szabadalmi bejelentés] MNG 00280. Az Escherichia coli törzsek növesztésére használt komplett folyadék táptalaj literenként 10 g Bacto-Tryptone-t, 5 g Bacto Yeast Extract-ot és 5 g NaCl-ot tartalmazott. Szilárd táptalaj készítéséhez a fenti összetételű médiumot literenként 15 g Bacto-agarral egészítettük ki. A j3-galaktozidáz enzim N-terminális rész (a-peptid) expressziójának becslésére alkalmas indikátor lemezek összetétele literenként. 20 g casaminosav 6 g Na2 HPO4 3 g KH2P04 0,5 g NaCl 1 g NH4C1 15 g Bacto-Agar 20 mg X-gal (dimetil-formamidban oldva) 2 mM MgClj 0,1 mM CaCl2 ßlaktamäz gént kódoló plazmidot tartalmazó sejteket 100 j^/ml koncentrációban ampicillint tartalmazó táptalajon növesztettük. Plazmid DNS izolálásához a megfelelő plazmidot tartalmazó baktérium törszet 100 /Jg/ml ampicillint tartalmazó táptalajon tenyésztettük és OD^oOnm 0.7-0.8 elérésekor 170 /rg/ml kloramfenikolt adtunk a kultúrához a plazmid amplifikálására. Preparatív méretekben történő plazmid DNS iizoláláskor a Clewed és Helinski által leírt módszerrel clear lizátumot készítettünk [Clewell, D. B. and Helinski, D. R., (1969) Supercolied circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induces conversion to an open circular RNA form. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 62, 1159-1166.], majd a plazmid DNS-t Sephacryl SI000 (Pharmacia) oszlopon vagy céziumklorid-ethidiumbromid sűrűség gradiensben ultracentrifugálva tisztítottuk. Analitikai méretekben történő plazmid DNS izolálására (1.0—1.5 ml baktérium kultúrából) a Bimbóim és Doly által kidolgozott és D. Ish-Horowich által módosított kálium-acetátos módszert alkalmaztuk [Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., New York], DNS minták hasítása restrikciós endonukleázokkal a New England BioLabs által javasolt reakció körülmények között történt. Egyesszálú végeket tartalmazó DNS fragmentumok tompa végűvé alakítására a restrikciós enzimmel végzett hasítás után a DNS-t alkohollal kicsaptuk, majd 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 7 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM dATP, 0.1 mM dCTP, 0.1 mM dGTP, 0.1 mM .TTP összetételű pufferben (végtérfogat 10-20 jbd, DNS koncentráció 200- 150 Mg/ml) oldottuk és 1-2 egység DNS polimeráz I Klenow fragmentummal 15 percet, 37°C-on inkubáltuk. Ragadós végű DNS fragmentumok összekapcsolásakor a reakcióelegy (30—40 #4) 0,5—1,0 p% DNS-t, 66 mM Tris-HCl-t (pH 7.6), 5 mM MgClj-ot, 5 mM dithiothreitolt, 1 mM ATP-t és 1 egység T4 indukált polinukleotid ligázt tartalmazott. A ligálást 2—3 órán át, 14°C-on végeztük (Maniatis T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, Cold 5 194 309 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
