194309. lajstromszámú szabadalom • Expressziós vektorok
1 lépésekből áll: 1. Az E. coli rrnB operonjának klónozása pBR322 vektorban. 2. Az operon promotereinek klónozása stabilan, plazmidokban, a strukturális gén nagy részének eltávolításával, a transzkripciós start (promoter) és stop (terminátor) régiók egymáshoz közel helyezése. 3. Az E. coli lac operon elejének összeépítése a lerövidített rrnB operonnal. 4. Hatékony transzlációt biztosító szabályozó régió kialakítása a transzkripciós és transzlációs start pontok közötti távolság változtatásával. 5. Az idegen gén beépítését lehetővé tevő restrikciós hasítási helyek kialakítása a plazmid megfelelő részén. Az E. coli rrnB riboszómális RNS operon izolálásához kiindulási anyagként szolgálhat az E. coli teljes DNS-e, vagy olyan transzdukáló bakteriofágok DNS-e, amelyek hordozzák az operont. Az rrnB operon izolálása a l-yrif^lS transzdukáló bakteriofág DNS-bői Kiss A. és mti. [1978, Gene 4, 137-152], az E. coli kromoszómából pedig Boros I. és mti [1979, Nucl. Acids. Res. 6, 1817-1830] módszerével történhet. A találmányban leírt pER plazmidok kialakításának első lépése a pBB9 jelzésű plazmid (MNG 00300) konstrukciója volt. (1. ábra) Ebben a pBR322 (MNG 00295) vektor plazmid [Sutcliffe, J. G., 1978, Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Ouant. Biol. 43, 77—90.] BamHI hasítási helyére a BamHI enzimmel hasított yyrifcl 18 DNS 7.5 kb fragmentumát építettük. A plazmidban a bakteriális eredetű rész a teljes rrnB operont tartalmazza, valamint ehhez egy kb. 400 bp hosszú lambda eredetű rész kapcsolódik. Az rrnB operon szabályozó régiójában a 16S rRNS géntől 180 és 300 nukleotidra két promoter található (Pj és P2) [Csordás Tóth és mti, 1979, Nucl. Acids Res. 7, 1335-1342]. Az rrnB operont, illetve annak promoter régióját tartalmazó plazmidokon az erős riboszómális promoterekről rendkívül intenzív transkripció iniciáció van. Ez oly mértékben igénybe veszi a plazmidot tartalmazó sejt enzimkészletét, hogy gátolja a sejt növekedését. Emiatt az ilyen konstrukciók instabilak. Az instabilitás elkerülésére ezért a pBB9 plazmidból in vitro képzett deléciókkal eltávolítottuk a továbbiak szempontjából nem lényeges részeket. Ehhez a pBB9 DNS-t Hpal restrikciós endonukleázzal hasítottuk és a lineáris molekulát különböző ideig BAL31 nukleázzal kezeltük. Az enzim egy exonukleolitikus degradációhoz hasonlóan, a molekula végeiről indulva, fokozatosan rövidíti a DNS-t mindkét polinukleotid láncon. A BAL31 nukleázzal különböző mértékben rövidített lineáris plazmidokat tartalmazó DNS mintát a tompa végek C szekapcsolására és a molekulák cirkularizálására egyaránt kedvező reakciókörülményeket választva, T4 polinukleotid ligázzal ligáitok és E. coli HB101 sejtekbe transzformáltuk. A plazmidot tartalmazó sejtekből egyedi kiónokat növesztettünk fel és azokból izoláltuk a plazmid DNS-t. Restrikciós endonukleázokkal hasítva gélelektroforézissel meghatároztuk a deléciók kiterjedését a minket érdeklő plazmidok keresésére azzpl az jgénnyel, hogy az érett rRNS-ekre jellemző 5 és 3 vég megőrzésével a lerövidített operonon szintetizáló RNS-ek az rRNS-ekre jellemző úton kerüljenek lebomlásra. Ennek a feltételnek meg2 felelő plazmidokat pBB9A9-val jelöljük, egyikük a pBB9YX9 (2. ábra). Nukleotid szekvencia meghatározás alapján 269 nukleotidot tartalmaz az érett 16S rRNS szekvencia elejéről és a teljes 5S rRNS gént az operon végén. A 16S rRNS eleje és a 23S rRNS gén vége közötti fúziós pont környezetének nukleotid szekvenciája a 3. ábra tartalmazza. A következő lépésben a plazmidot tovább alakítottuk azzal a céllal, hogy minél kisebb plazmidban legyen a deléciós- operon. A pBB9A9 plazmidot a pBR eredetű részben egy helyen hasító Sáli endonukleázzal linearizáltuk (4. ábra). (Az rrnB operonban lévő két másik Sáli hasítási helyet az előbbi deléció már eltávolította.) Mivel kb. 800 nukleotid a távolság a Sáli hasítási hely és az rrnB operon vége között, a lineáris molekulát addig emésztettük BAL 31 nukleázzal, hogy kb. 1600 nukleotiddal rövidüljön meg. Azzal a céllal, hogy a deléciót az rRNS operonnal ellentétes irányba megnyújtsuk és nem esszenciális vektor részeket is eltávolítsunk, a DNS-t cirkularizálás előtt PvuII-enzimmel is emésztettük. A PvuII tompa véget hoz létre, ami további kezelés nélkül a BAL 31 nukleázzal képzett végekhez kapcsolható. Az előbbihez hasonlóan végeztük a DNS ligálását, a transzformációt és egyedi kiónok fizikai térképezését a további munkánkhoz legjobban megfelelő plazmid kiválasztására. A pBB9b28 jelzésű plazmidban a SalI-BAL31-PvuII enzimekkel képzett deléció 2174 bp. A deléció az érett 5S szekvencia mögött 510 nukleotiddal kezdődik és a pBR322 plazmid PvuII hasítási helyénél - a vektoron alkalmazott számozás szerint 2067 — végződik. A bakteriális és pBR322 eredetű részek csatlakozási pontjának nukleotid szekvenciáját a 3. ábra tartalmazza. A harmadik deléciót az rRNS operon promoter régiója előtti rész eltávolítására hoztuk létre. A pBB9b28 plazmidot a 16S rRNS gén előtt egy-egy helyen hasító EcoRI és RspII endonukleázokkal emésztettük és izoláltuk a vektort és az rrnB operon részét tartalmazó fragmentumokat (4. ábra) E és F közötti rész. Az EcoRI és FspII hasítására képződött fragmentum végeinek egyesszálú részeit az E. coli DNS polimeráz I Klenow szubfragmentumának segítségével tompa végekre egészítettük ki, majd T4 indukált polinukeotid ligázzal összekapcsoltuk. A helyesen feltöltött végek összekapcsolásával a cirkulási molekulában helyreáll az EcoRI és FspII enzimek által felismert 6—6 nukleotidból álló szekvencia részlet : -GAATTCGAA(-CTT AAGCTT-), tehát a transzformáció után izolált plazmid (p408- -5, MNG 00301) mindkét enzimmel linearizálható (5. ábra). A p408-5 plazmid DNS-t linearizáltuk a Pi promoter Pribnow-box előtt 100 nukleotiddal hasító FspII endonukleázzal és enyhe BAL 31 nukleáz kezeléssel a Pj promoter felé haladó deléciósorozatot képeztünk (5. ábra). A ligálás és transzformáció után izolált plazmid DNS-ekben a BspRI, Mspl és Hhal restrikciós endonukleázok hasítási helyeinek térképezésével és nukleotid szekvencia meghatározással azonosítottuk a deléció végpontjait. A p419- •13 jelzésű plazmidban a 164 bp kiterjedésű deléció 25 nukleotiddal a Pi prototer előtt végződik, a p419-10 plazmidban pedig a deléció (197bp) eltávolította a Pj protomotert és a Pj előtt néhány 194 309 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
