194308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására
1 194 308 2 A találmány tárgya eljárás oligo- és polidezoxlribonukleotidok előállítására kémiailag szintetizált egyes szálú DNS szakasz komplementer szálának enzimatikus úton, Klenow polimeráz segítségével, dezoxlribonukleozld 5 ’-trifoszfátok jelenlétében végzett kialakításával, oly módon, hogy a komplementer szál enzimatikus szintézisét klónozó vektorban végezzük. Az elmúlt két évtized szerves kémiai alapkutatásai közül kiemelkedő fontosságú szerepet játszott a specifikus nukleotidszekvendával rendelkező oligodezoxirlbonukleotldok kémai szintézise [Khorana H. G. (1979) Science 203, 614, Itakura K. és Riggs A. D. (1980) Science 209, 1401]. Az alapkutatáson túlmenően ezek a vegyületek a rohamosan fejlődő génsebészet és az ezen alapuló alkalmazott tudományág, a biotechnológia nélkülözhetetlen segédeszközévé váltak. Az immár hagyományos, enzimatikus reakciókra épülő génsebészet, az In vitro DNS rekombináció számára új távlatokat nyitott a szintetikus DNS darabok sokrétű alkalmazása. Ilyenek például: a különböző összekötő szakaszok (restrikciós linkerek és adapterek), az egyes gének azonosítására vagy izolálására szolgáló úgynevezett hibridizációs próbák, valamint a klónozott gének helyspecifikus in vitro mutációjára használható oligodezoxiribonukleotidok. A génkifejeződés szempontjából nagy jelentőséggel bír olyan DNS szakaszok szintézise, amelyek a transzkripció és a transzláció szabályozásában játszanak szerepet. Nem elhanyagolható jelentőségű a szintetikus szempontból legmunkaigényesebb alkalmazás, egyes gének (amelyek lehetnek természetes gének, vagy pedig adott fehérjék termeltetése szempontjából mesterségesen megtervezettek) teljes kémiai szintézise. Ennek az alkalmazásnak különösen akkor van nagy jelentősége, ha az adott gén természetes forrásból nehezen izolálható, vagy pedig az általa kódolt információ a génkifejezésre kiválasztott organizmusban az eredetitől, a kívánttól eltérő terméket eredményezne. A fenti alkalmazás-példák alapján nem meglepő, hogy az utóbbi években, és napjainkban Is, egyre több kutatócsoport figyelme irányult a kémiai DNS szintézis gyorsabbá és egyszerűbbé tételére. Ezek a törekvések elsősorban a szintézis során alkalmazott optimális védőcsoportok kidolgozására, a kapcsolási reakciók gyorsabbá és teljesebbé tételére, a szintetikus Intermedierek tisztítás nélküli további felhasználására és a végtermék hatékony végső tisztítására irányultak. Az optimális védőcsoportok és kapcsolási reakciók megfelelően megválasztott szilárd fázison való alkalmazása lehetővé tette olyan félautomata, illetve automata DNS szintetizátorok létrehozását, amelyekkel egy adott DNS lánc egy vagy két tetszőleges nukleotiddal való hosszabbítása csupán 20— 30 percet igényel. Bármennyire gyorsak és hatékonyak is fenti módszerek, az alkalmazott kémiától és a készüléktől függően általában csupán 10-40 nukleotid hosszúságú, egyes szálú DNS szakaszok előállítására alkalmasak. Ráadásul az így kapható oligomerekre kidolgozott fizikai-kémiai elválasztási, tisztítási műveletek (például: gélelektroforézis, kromatográfla, beleértve HPLC) nem feltétlenül eredményeznek biokémiai, klónozás! szempontból homogén végterméket. A kémiai eljárások fent említett korlátái és hátrányai miatt felmerül a kémiai és az enzimatikus módszerek együttes alkalmazása a szintetikus munka gyorsabbá tételére, valamint ezeknek a klónozás! módszerekkel való kombinálása. Lényeges egyszerűsítést jelenthet, ha az előállítani kívánt DNS szakaszok csak egyik szála készül kémia] módszerekkel, míg a másik szál részben, vagy csaknem teljes egészében enzimatikus szintézissel épül fel az első szál mentén történő másolással. Az időfaktoron túlmenően ilyen eljárás jelentős költségcsökkenéssel is jár, mivel az enzimatikus szintézis prekurzoaira, a dezoxiribonukleozid trifoszfátokra a kémiai szintézis alapanyagaihoz képest nagyságrendekkel kisebb- mennyiségben van szükség. Az egyik ilyen megoldás azon az ismereten alapszik, hogy az E. coli DNS polimeráz I úgynevezett nagy fragmentuma (más névvel Klenow polimeráz) a részlegesen kettős szálú DNS-t teljesen kettős szálúvá képes alakítani megfelelő dezoxiribonukleozld trifoszfátok jelenlétében úgy, hogy a rövidebb DNS láncot (indító szakasz vagy primer) a hosszabb lánc (templát) mentén másolási reakcióval 5 -3 Irányban az utóbbi láncnak megfelelő hosszúságig feltölti [Manlatis T., Fritsch E. F. és Sambrook J. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. 113-116. oldal]. Ennek felhasználásával Itakura és munkatársai [Rossi J. J. Kierzek R., Huang T., Walker P. A. és Itakura K. (1982) J. Biol. Chem. 257, 9226] úgy jártak el, hogy két, viszonylag hosszú (38-43 tagszámú) oligonukleotidot állítottak elő kémiailag, amelyek 3 -végükön 9—10 bázispárnyi szakaszon átfedésben voltak. A két oligonukleotid hibridizációja és Klenow-polimerázzal, mind a négy dezoxiribonukleotid trifoszfát jelenlétében végzett feltöltése után a részlegesen (9-10 bázispárra kiterjedő) kettős szálú szakaszból 72 bázispárnyi kettős szálú szakaszt állítottak elő. Az eljárásuk rendkívül szellemes, mivel mindkét oligonukleotid egyúttal primerként és templátként is szolgál. Hasonló módon jártak el Narag és munkatársai [Scarpulla R. S., Narang S. A. és Wu. R. (1982) Anal. Biochemistry 121, 356] az emberi inzulin A láncát kódoló mesterséges gén szintézise során, eljárásukban a különbség elsősorban annyi, hogy a kettős szál feltöltésére Klenow polimeráz helyett reverz transzkriptázt alkalmaztak. A fenti eljárásokkal kapott kettős szálú DNS szakaszok ezután valamilyen vektorban klónozásra kerülnek. Mivel a klónozó vektort az orientált beültetés miatt célszerű két, az adott vektort csupán egyszer hasító, különböző specificitású restrikciós endonukleázzal hasítani, a klónozandó DNS szakaszt is el kell látni ezeknek megfelelő végekkel. Ez történhet egyrészt úgy, hogy a kettős szál két végét két egymást követő ligálás során különböző restrikciós lhíkerrel hosszabbítják meg, majd a megfelelő két restrikciós enzimmel végzett kombinált emésztés után kapják meg a klónozásra alkalmas, két megfelelő ragadós véget tartalmazó DNS szakaszt [(Scarpulla R. S„ Narang S. A. és Wu. W. (1982) Anal. Biochemistry 121, 356), ahol így egy 75 bázispárnyi, orientált beépítésre alkalmas DNS darabot kaptak], Ennél azonban, ha hosszabb DNS szakasz előállítása és klónozása a cél, egyszerűbb és gazdaságosabb, ha két kettős szálú DNS szakaszt állítanak elő, amelyek közül az egyik eleve tartalmazza az 5 -végén az egyik restrikciós enzimnek megfelelő felismerő helyet, míg a másik a 3-végén a másik enzimnek megfelelő felismerő helyet [Rossi J. J„ Kierzek R., Huang T., Walker P. A. és Itakura K. (1982) I. Bioi. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
