194308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására
1 194 308 2 Chem, 257, 9226J. A két szakaszt ezután külön-kü- Jön hasítják a két megfelelő restrikciós enzimmel, majd ezeknek a megfelelően hasított klónozó vektorral való kombinálása, hármas ligálás és a kapott ligátum alkalmasan megválasztott E. coll törzsbe való transzformálása után olyan rekombináns nyerhető, amelyben a klónozó vektor tartalmazza a két, egymással megfelelően összekapcsolt DNS szakaszt. A fentiekben felsorolt, eddig ismert eljárások hátrányai: 1. A kémiailag szintetizált DNS daraboknak egyenként tartalmazniuk kell a hibridizációhoz, szükséges átfedő szakaszokat (9-10 nukleotid) a 3’-vékükön, valamint a restrikciós helyeket, s ezeknek a helyeknek hatékony hasításához szükséges, 2-4 nukletotidnyi szakaszt is (összesen újabb 8-10 nukleotid). Az Dyen szakaszok kémiai szintézise a végtermék szempontjából feleslegesnek minősíthető. 2. Klónozás előtt az egyes szálú oligonukleotidokat, majd feltöltés után a kettős szálú DNS szakaszt Is tisztítani kell. Kidolgoztunk egy olyan általános eljárást, amely szerint a kémiailag szintetizált egyes szálú DNS komplementere szintén enziniatikusan képződik, de kiküszöböli a fent említett hátrányokat. A találmány szerinti eljárás három módon valósítható meg, melyek közös jellemző vonása az, hogy a kémiailag előállított egyes szálú dezoxioligoribonukleotidot közvetlenül, vagy egy adaptermolekula segítségével megfelelően hasított klónozó vektorhoz kapcsoljuk, s az így módosult vektor a polimeráz feltöltésben primer-templát rendszerként működik úgy, hogy templátként a vektorhoz ligáit egyes szálú szakasz, printerként pedig a vektor nem ligáit, vagy csak az adapterhez ligáit szála szolgál. A komplementer szál szintézise tehát teljes egészében enzimatikusán történik, a klónozó vektorhoz kapcsoltan, és ezáltal azonnal lehetségessé válik a kapott kettős szálú szakasz klónozása is. A találmány szerinti eljárás lényege részletesebben a következő. A klónozásra kiválasztott vektort két olyan restrikciós endonukleázzal hasítjuk, amelyeknek megfelelő felismerő szekvencia a vektorban egyedi, s az egyik enzim 5-túlnyúló, a másik pedig 3 -túlnyúló véget eredményez. A kémiailag előállított egyes szálú, 5-foszfát csoporttal ellátott DNS szakaszt, amelynek 3-végszekvenciája kompleme.nter a hasított vektor 3 - túlnyomó végével (de 5 -végszekvenciája nem komplementer a hasított vektor 5 -túlnyúló végével) közvetlenül a vektorhoz ligáljuk T4 DNS ligáz segítségével (1. ábra). Ligálás után a lineáris vektor úgy módosul, hogy mindkét végén 5 -túlnyúló szakaszt tartalmaz az egyik az 5-túlnyúló véget eredményező hasításból, a másik pedig a 3’-túlnyúló vég és a szintetikus egyes szálú DNS szakasz összekapcsolódásából származót. Az 5 -túlnyúló végeket ezután E. coli DNS poümeráz I nagy fragmentumával (Klenow polimeráz) a négy dezoxlribonukleozid 5 -trifoszfát jelenlétében feltöltjük. Tehát a szintetikus egyes szálú DNS szakasz komplementer szálának szintézise enzimatikusan, klónozó vektoron belül történik úgy, hogy printerként a vektor nem ligáit szála szolgál. A lineáris, módosított vektort, amelynek mindkét vége feltöltött, kettős szálú (blunt end), T4 DNS ligázzal körré zárjuk. A fenti lépések során kapott ligáit reakcióelegygyel .ezután alkalmasan kezelt baktériumsejteket (E. coli) transzformálunk. A várt rekombinánsokat ezután kettős szelekcióval választjuk ki. Az egyik szelekciós elv a klónozó vektor ab ovo tulajdonsága (például plakk képződés fág vektor esetén, vagy antibiotikum rezistens kolóniaképződés plazmld vektor esetén), a másik szelekciós elv pedig olyan fenotípusos tulajdonságon alapszik, amit a kapott rekombinánsnak a klónozandó DNS szakasz megléte eredményezhet. A kiválasztott kiónokat, amelyek nagy valószínűséggel tartalmazzák a szintetikus DNS darabot és ennek komplementer szálát is, részleges vagy teljes DNS szekvenálás segítségével azonosítjuk. Előnyösen alkalmazható nagyszámú rekombináns egyidejű sereenelésére a didezoxi láncterminációs eljárás [Sanger F„ Nicklen S. és Coulson A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463], Az így kiválasztott kiónból a vektort ismert módszerekkel izoláljuk [például Bimbóim H. C. és Doly J. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1513, Messing J., Créa R. és Seeburg P. H. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 209]. A kapott vektorból a klónozandó DNS szakasz megfelelően előállított szekvenciája esetén (egy adott nukleotid az 5 -végen, s öt nukleotidnyi szekvencia a 3 -végen) a klónozott kettős szálú DNS szakasz a kiindulásnál felhasznált enzimekkel kihasítható. A további felhasználástól függően ezek az enzimek egyidejűleg, vagy egymás után megfelelő sorrendben, esetleg más enzimatikus lépésekkel (például: SÍ nukleáz, vagy Klenow polimeráz + dezoxinukleozid trifoszfátok) kombinálhatok, s ezek eredményeként az alkalmazott enzimeknek megfelelő végű részletesen kettős szálú, teljesen kettős szálú, vagy szálelválasztás után egyes szálú DNS szakaszok izolálhatók (2. ábra). A módszer előnyös továbbfejlesztése, amikor a fenti klónozási folyamat több oligonukleotiddal ciklikusan ismétlődik, s az egyes oligonukleotidok a klónozó vektoron belül egymáshoz kapcsolódnak. Ez kétféleképpen történhet, attól függően, hogy a már klónozott első oligonukleotidot részlegesen kettős szálú formában izoláljuk, s a második egyes szálú oligonukleotiddal kombinálva az eredeti, vagy a második klónozás szempontjából előnyösen megválasztott másik klónozó vektorban újra klónozzuk (Az út), vagy pedig az első klónozott oligonukleotidot a rekombináns vektorban hagyjuk, s a rekombináns vektort úgy hasítjuk, hogy ez a hasítás lehetővé teszi a második oligonukleotid vektorhoz való ligájását, majd a vektoron belül az első oligonukleotidhoz való kapcsolását, s a két összekapcsolt oligonukleotid klónozását is (B út). A út Amennyiben az először klónozott oligonukleotid a vektorból történő megfelelő hasítással (2. ábra, PstI, SÍ nukleáz vagy Klenow polimeráz + dezoxinukleozid trifoszfátok, majd BamHl lépések) izolálásra kerül, ennek a második, egyes szálú oligonukleotiddal való összekapcsolása és újraklónozása vagy az eredeti, vagy a várható rekombinánsok szelekciója szempontjából alkalmasan megválasztott másik vektorban történhet (3. a és 3. b). Megjegyzendő, hogy tt szelekció szempontjából nem feltétlenül szükséges, egy új, 3 -túlnyúló véget (például 3. b ábrán PstI helyett SstI) eredményező vektor alkalmazása. Erre 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
