194307. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy kópiaszámú plazmidvektorok előállítására
1 A találmány nagy kópiaszámú plazmidvektorok előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik. A génmanipulációs (génsebészeti) technika leggyakoribb Ipari alkalmazása az, hogy az előállítani kívánt terméket kódoló génszakaszt beépítik egy úgynevezett vektorplazmidba és ezt a plazmidot bejuttatják egy alkalmas gazdabaktériumba. A plazmid a baktériummal együtt szaporodik, és a beültetett gén működik. A géntermék mennyisége függ a transzláció és a transzkripció Intenzitásától, a termék sejten belüli bomlásától és a kérdéses gén (azaz a gént hordozó plazmid) példányszámától. Ha tehát sikerül egy plazmid sejtenként! kópiaszámát növelni, a kívánt terméket kódoló idegen gén kópiaszámának megnövelésén keresztül a géntermék termelésének jelentős növekedése érhető el. Célul tűztük ki olyan új plazmidvektorok előállítását, amelynek sejtenként! kópiaszáma lényegesen meghaladhatja az ismert és elteijedten alkalmazott plazmidok kópiaszámát. * 'A tudományos kutatás és az ipar igen nagyszámú, különböző célokra alkalmas, általában mesterségesen konstruált vektorplazmidot használ. Az egyik legelterjedtebben haszmált Ilyen plazmid a pRR322, amelyet Boyer és munkatársai konstruáltak [Gene 2 (1977) 95]. Miután az eddig összegyűlt tudományos Ismeretek ezzel a plazmiddal kapcsolatban a legbőségesebbek, és ezt illetve származékait használták plazmid replikonként a legtöbb alkalommal gén klónozásra, kísérleteink során ezt a plazmidot használtuk kiinduló anyagként. A plazmid szerkezetét Sutcliffe határozta meg [CSH Symp; Quant. Bioi. 43 (1979) 77-90] és az 1. ábra szemlélteti. Éz a plazmid 4362 bázispár hosszúságú. A plazmid replikációja (Rep) a 2536. nukleotidnál indul, az óramutató járásával ellenkező irányba, sejtenkénti kópiaszáma átlagosan 20-50. A kópiaszámot egy bonyolult szabályozó mechanizmus biztosítja [Plasmid 9 (1983) 1). A 2978. és 3081. nukleotidok közötti szakasz egy kismolekulájú RNS szintéziséért felelős, amely nem kódol fehérjét, átírása az óramutató járásával egyező irányban történik, elég nagy intenzitással. Ez a kismolekulájú RNS a plazmidreplikáció negatív regulátora — represszora. Találmányunk alapját az a felismerés képezi, hogy kitűzött célunk, a plazmid kópiaszámának növelése úgy érhető el, hogy ebben a plazmidreplikáció represszorának termeléséért felelős génszakaszban olyan mutációt hozunk létre, amely a génszakasznak ezt a funkcióját megszünteti. Találmányunk tehát ilyen eljárásra vonatkozik. Laboratóriumunkban az első nagy kópiaszámú plazmidot (pHG) pBR322 vektor EcoRI és BamHI hasítási helyei között idegen DNS-t tartalmazó amp , tets feno-típusú plazmidokkal végzett kísérletben, kb. 5000 független plazmidból álló rekombináns halmaz analízisekor, spontán fellépett mutáció eredményeként izoláltuk. A pHCl plazmidot tartalmazó baktérium sejtekből ampli fik álás nélkül, mint egy hússzor olyan mennyiségű plazmid DNS-t lehetett izolálni, mint azonos módszerekkel, a hasonló szerkezetű rekombináns molekulát tartalmazó klónokból. A pHG plazmid DNS többszörös újratranszformálása E coli HB101 (pro", leu", thi", lac", str-, r-m'endol", recA") [Boyer, H. W. Roulland-Dussoix, D.: J. Mól. Bioi. 4L 459-472 (1969)], C600 fo*. mk", thi", thr", leu", lac") [Boyer, H. W. és munkatársa1 fenti cikke], ED8800 (SupE, supF, hsdS", 2 met, lacZM15, recA56) [Murray, N. E., Brammar, W. J,, Murray, N. E., Brammar, W. J., Munay, K.: Mol. gen. Genet. 150, 53-61 (1977)] gazda sejteket használva minden alkalommal nagy mennyiségű plazmidot tartalmazó ampr, tets kiónokat eredményezett. Ezért a pBR plazmidokra jellemzőnél húszszor nagyobb kópiaszám okaként a plazmid DNS- ben bekövetkező, öröklődő változást tételeztünk fel. A nagy kópiaszámot okozó mutáció azonosítása A pHCl plazmidot az EcoRI és PvuII restrikciós endonukleázzal hasítottuk, majd az EcoRI enzim hatására képződött egyesszálú végeket a DNS polimerázl enzim Klenow szubfragmentumával, dNTP szubsztrátok jelenlétében feltöltöttük. Az így képzett tompa végű DNS molekulákat polinuídeotid ligáz enzimmel cirkularizáltuk és HB101 sejtekbe transzformáltuk. Az ampicillin tartalmú táptalajon kinövesztett egyedi kolóniákból plazmid DNS-t izoláltunk és a nagy mennyiségben izolálható DNS mintákat EcoRI, PvuII és BspRI restrikciós endonukleázokkal hasítva agaróz és poliakrflamid gélelektroforézissel analizáltuk. A további munkához kiválasztott pHC81 plazmidot (2. ábra) a PvuII enzim nem hasította, az EcoRI pedig linearizálta. A plaznid teljes molekulasúlya (2,3 kb) és a BspRI hasítására képződő fragmentumok mérete alapján (587, 457, 434, 267, 240, 80 . . . bp) megállapítottuk, hogy a pHC81 és pBR322 plazmid 2069. és 2. nukleotidjai közötti részét tartalmazza a nagy kópiaszámot okozó mutációval, ami nem olyan típusú megváltozás, hogy az alkalmazott enzimekkel képzett valamelyik fragmentum mérete alapján észlelhető lenne. A mutáció helyének pontosabb lokalizálására Izoláltuk a PstI és Taql restrikciós endonukleázokkal hasított pHC81 DNS fragmentumai közül 1030 bp hosszúságút, a PstI és Clal enzimekkel emésztett pBR322 DNS-ből a 780 bp-os, valamint a Taql enzimmel hasított pBR329 DNS-ből a 218 bp-os fragmentumot. A három DNS fragmentumot ekvimoláris arányban összekeverve, poHnukleotid ligázzal összekapcsoltuk, majd a llgátummal HB101 sejteket transzformáltunk. Az ampicilUn tartalmú táptalajon elszaporított egyedi kiónokból plazmid DNS-t izoláltunk. Ezekre a plazmidokra jellemző volt a nagy kópiaszámú fenotípus. A • plazmid DNS-ek restrikciós endonukleázokkal végzett hasításával megállapítottuk, hogy ezek, a három különböző eredetű és jól megkülönböztethető fragmentum összekapcsolódásával jöttek létre olymódon, hogy a képzett plazmidokban pBR322 eredetű j3-laktamáz gén proxjmálls része, pBR329 eredetű a replikációs origót tartalmazó régió, a pHC81-ből izolált fragmentum pedig a /3-laktamáz gén disztális részén kívül a nagy kópiaszámot okozó mutációt is tartalmazza. A kísérlet szerint tehát arra következtettünk, hogy a mutáció a pBR322 plazmid DNS 2573 (Taql) és 3612 (PstI) nukleotidjai közötti részen van. Ennek a régiónak meghatároztuk a nukleotid szekvenciáját és az ismert pBR322 szekvenciával összehasonlítva megállapítottuk, hogy a 3074. nukleotidnál történt egy G— T tranzició (G=dezoxiguanil, T-timidil), ami a komplementer DNS-szálban C—A tranziciónak (C=dezoxÍcitozD, A=dezoxladenil) felel meg. A létrejött pontmutáció következtében károsodik a represszor RNS transzkripciójának termináció194 307 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
