194307. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy kópiaszámú plazmidvektorok előállítására
1 194 307 2 ja, egy nagyobb molekulasúlyú RNS szlntetízálódflc, amely már nem képes repllkádós represszorként működni. Ennek eredménye a nagyobb kópiaszám. A spontán pontmutádóval — ami célzottan Is létrehozható - a plazmld sejtenként! kópiaszámát mintegy 20-30-szorosra (~1000) sikerült növelni. Ez a pontmutádó a pBR322-n kívül minden olyan plazmld sejtenként! kópiaszámának jelentős növelésére is alkalmas, amely a pBR322-vel azonos repllkádós régióval rendelkezik. Azt találtuk azonban, hogy ha a G—T pontmutádót az eredeti pBR322 plazmldban hozzuk létre, az nem létképes. Ennek oka, hogy a plazmld antibiotikum rezisztenciát meghatározó génjein - Ap = = béta-laktamáz és Tt = membrán fehéije(k) - a nagy kópiaszám következtében mindkét fehérje szintézise fokozódik, és az utóbbi (a tetraciklin-rezisztenclát okozó membránfehérje) ebben a mennyiségben már letális a sejt számára. Ugyanez a probléma jelentkezik a pBR322 minden az eredeti tetraciklinrezisztencia gént változatlan formában tartalmazó származéka esetében. Előbb ismertetett kísérletünkben azért nem találkoztunk ilyen nehézséggel, mert olyan plazmidokkal dolgoztunk, amelyekben a pBR 322 plazmid BamHl-EcoRI helyére idegen DNS fregmentumokat klónoztunk, és ezzel ínaktiváltuk a tetraciklin-rezisztencia gént. A megoldás tehát a pBR322 plazmldban vagy azonos repllkádós régióval rendelkező származékában létrehozott olyan változtatás, amely inaktiválja vagy mérsékli a tetraciklin-rezistenda gén működését. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítás! módja szerint a pBR322, származékai vagy ezzel azonos repllkádós régióval rendelkező plazmidok a tetraciklinrezisztendát okozó membránfehérje termeléséért felelős gént nem, inaktivált vagy csökkentett működést biztosító formában tartalmazó származékain, a represszor RNS-t kódoló génszakaszon a represszor termelését módosító pontmutáclót hozunk létre. Különösen előnyösen, a pBR322, ennek származéka vagy más, de azonos repllkádós régiót tartalmazó plazmld DNS-ben a pBR322 számozása szerint 3074. pozícióban a GC bázispárt TA-ra cseréljük irányított mutádóval vagy bármely, a későbbiekben ismertetésre kerülő pHC plazmid megfelelő, mutádót tartalmazó részének kicserélésével a kívánt plazmid ettől a mutációtól eltekintve teljesen azonos régiójával. Mint már említettük, a GC—TA pontmutádót a pBR322 vagy ezzel azonos repllkádós régióval rendelkező plazmidnak olyan származékán kell létrehozni, amely nem, inaktivált vagy csökkent mértékű fehérjeszintézist biztosító formában tartalmazza a tetraciklln-rezlsztendát biztosító membránfehéijét kódoló gént. Különösen előnyös a tetraciklin-rezisztenciát biztosító DNS, vagy akár ezén túlmenően egészen a repllkádós origóig teijedő pBR322 rész eltávolítása és szintetikus eredetű pollllnkene történő helyettesítése, ami az így a plazmidba épített restrikdós endonukleáz hasítási helyek következtében Igen kibővíti a kapott plazmidok alkalmazhatóságának lehetőségeit. A pHC314, pHCll2 és pHC624 vektorok konstrukciója Az előzőekben Ismertetett kísérletekben kapott pHC plazmidok további átalakítása során, azért, hogy .ezekből különböző restrikdós endonuldeázokkal képzett DNS fragmentumok beépítésére alkalmas vektorokat alakítsunk ki, pollUnkereket inszertiltunk a pHC81 plazmidba. Az EcoRI endonukleázzal 11- nearizált pHC81 plazmld DNS-t bakteriális alkalikus foszfatázzal defoszforDált, EcoRI enzimmel emésztett rrvx plazmid DNS [Seed, B.: Nucleic Adds Research, 11 2427-2446 (1983)] fragmentumokkal llgáltuk és a ligátummal E. coll HB101 sejteket transzformáltunk. Az Ap rezlsztens baktérium kolóniákból plazmid DNS-t izoláltunk és azokat EcoRI és PstI restrikdós endonukleázokkal hasítva gélelektroforézissel analizáltuk. A további átalakításhoz azt a plazmidot választottuk (pHC314, 3. ábra), amelyiket az EcoRI 2300 és 110, a PstI pedig 1580 és 820 bázispáros fragmentumokra hasít. Ebből a plazmidból a csak egy EcoRI helyet tartalmazó pHC312 kialakítása a következő módon történt: BamHI restrikdós endonukleázzal hasítottuk a plazmidot, majd a lineáris molekulát Hinfl enzimmel részlegesen emésztettük. A DNS fragmentumokat 1,2%-os agaróz gélben elválasztottuk és izoláltuk a gélből a 2010 bp-os fragmentumot. A molekulalák BamHI és Hinfl enzimek hasítására képződött egyesszálú részeket tartalmazó végeit a DNS polimerázl enzim Klenow szubfragmentumával tompa végekké alakítottuk, majd T4 Indukált polinukleotid Ugázzal cirkularizáltuk. HB101 sejtekbe transzformálva a ligáit DNS-t egyedi kiónokat izoláltunk és a további munkához kiválasztottuk a BamHI endonukleázzal nem hasítható, EcoRI-gyel linearizálható, Hinfl hasítására pedig 1495 és 516 bp-os fragmentumokra darabolható pHC312 plazmidot (4. ábra). Tompa végű DNS fragmentumok klónozására alkalmas, nagy kópia számú vektor kialakítsam a pHC312 plazmidot EcoRI és HindlII restrikdós endonukleázokkal hasítottuk és agaróz gélből izoláltuk az 1980 bp-os nagy fragmentumot. Ehhez EcoRI és HindlII enzimekkel emésztettnAN7 plazmid [Seed, B.: Nucleic Adds Research, 11 2427-2446 (1983)] DNS-t kevertünk és polinukleotid ligázzal összekapcsoltuk a molekulákat. A ligáit mintával E. coli HB101 sejteket transzformáltunk és egyedi, Ap rezisztens baktérium kiónokból plazmld DNS-t izoláltunk. Az így előállított plazmid DNS (pHC624, 5. ábra) nem tartalmaz Gál hasítási helyet, a pHC312 plazmidtól eltérően azonban Smal, Sáli és BamHI restrikdós endonukleázokkal linearizálható. A kísérletekben a következő anyagokat és módszereket alkalmaz tűk: Baktérium törzsek és plazmidok: pBR322 amp, ter [Bolivar, F., Rodriguez, R. L., Greene, P. J., Betlach, M. C., Heynecker, H. L., Boyer, H. W., Crosa, J. H., Falkow, S.: Gene, 2 95 (1977)]. pBR329 ampr, chlr, tetr [Covarrubias, L., Bolivár, F.: Gene, í 7, 79-89(1982)].____ Á wVX és wAN7 plazmid DNS preparátumok az SZBK Biokémiai Intézetben készültek [Seed, B.: Nucleic Adds Research, 11, 2427-2446 (1983)]. A használt restrikdós endonukleáz, T4 indukált polinukleotid kínáz és polinukleotid Ugáz preparátumokat az MTA SZBK Biokémiai Intézet munkatársai készítették a közölt tisztítási eljárásokat alkalmazva [Roberts, R. J.: Nudeic Adds Res. 11 rl35-rl37 6 10 15 ( 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
