194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 merte tett módszerével) hosszabbítjuk meg dCMP-vel. 150 ng fenti kettősláncú cDNS-t 8 pl 100 mmól/ liter nátrium-kakodflátot (pH = 7,2), 2,5 mmól/litcrr CoClj-t, 50 ptg/pd BSA-t, 0,1 mnról/liter dCPT-t, pg DNS-enként 3 -6 egységnyi tisztított TdT-t tartalmazó oldatban 8 percen át 27°C liőmérsékleten inkubáljuk, majd -20°C-ra hűtjük. így - hasonlóan a fentiekhez - különböző fajtájú dCMP-vel meghosszabbított DNS keveréket kapunk, melyek közül csak nagyon kevés vonatkozik IFN-re (1. ábra) 3. Ca"*-rnal kezelt E. coli XI176 előállítása 100 ml tripton táptalajt (C. Weissmann és W. Boll, ,,Reduction of Possible Hazards In The Preparation Of Recombinant Plasmid DNA , Nature. 261, 428— 29. o. (1976)) - melyet 100 pg/rnl diaminopimelinsawal (Koch-Light Laboratories), 10 pg/ml nalidixsawal (Calbiochem) és 10 ptg/ml tetraciklinnel (AchromyciriR, American Cyanamid) egészítünk ki — E. coli XI776 egy telepével beoltunk, majd a kultúrát 37°C-on 650 nm hullámhossznál mért 0,6 optikai sűrűség eléréséig (ODss0) (melyet Beckmann DB spektrofotométerrel határozunk meg) tenyésztjük, ezután jégen hűtjük 30 percig. A tenyészetet 4000 fordulat/percnél Sorvall H4 billenőedényes rotorban ülepítjük. A sejteket 50 ml 10 mmólos NaCl-lel mossuk, centrifugálással újra üledékbe visszük és 20 ml 100 mmólos CaCl2 oldatban újraszuszpendáljuk. A szuszpenziót jégben 30 percen át hűtjük, centrifugálással ülepítjük, és 4 ml 100 mmólos CaG2 oldatban újra-szuszpendáljuk, majd éjjelen át jégben tartjuk a felhasználás céljából. Transzformáció céljából az E. coli HB 101 -t M. Mandel és A. Higa módszerével [„Calcium-Dependent Bacteriophage DNA Infection,,, J. Mol. Biol. 53, 159-162. o. (1970)] állítjuk elő. 0,5 ml-es alikvot részeket —70°C-on fagyasztva tartva legalább 3 hónapig megőrizhetjük aktivitásukat. 4. dGMP-vel meghosszabbított pBR322 és dCMP-vel meghosszabbított DNS összekapcsolása Farokrésszel ellátott, Pstl-gyel hasított pBRS22-öt és farokrésszel rendelkező cDNS-t J. Van den Berg és munkatársai módszerével [„Comparison Of Cloned Rabbit And Mouse (3-globin Genes Showing Strong Evolutionary Divergence Of Two Homologous Pairs Of Tntrons’, Nature, 276, 37—44. (1978)]. kapcsoljuk össze. dCMP-vel meghosszabbított DNS 8 ng-ját dGMP-vel meghosszabbított Pstl-gyel hasított pBR322 22 ng-jával 50 pl TNE pufferben összekeverünk 4 egymás utáni 1 órás 65°C, 46°C, 37°C és 20°C hőmérsékletű inkubálás után 20 ß 100 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH = 7,5), 100 mmól/liter CaClj -t, 100 mmól/liter MgClj-ot tartalmazó oldatot és 50 ß TNE puffert adunk hozzá és 20 percen át jégben hűtjük. így termékként nagyszámú különböző rekombináns DNS molekulák keverékét és néhány, az inszertált DNS szekvenciák nélküli klón hordozót kapunk. Azonban valamennyi rekombináns DNS molekula a PstI helyen egy cDNS szegments tartalmaz. Mindegyik ilyen cDNS szegmens egy gént vagy annak fragmensét tartalmazhatja. Azonban csak nagyon kevés cDNS szegmens kódol IFN-t vagy annak részletét (1. ábra). A legtöbb a találmány szerinti eljárásban használt poli(A)RNS-nek részeit képező mRNS-eknek megfelelő fehérjéket vagy azok részeit kódolja (1. ábra). 5. E. coli XI 776-nak az összekapcsolt hibrid plazmidokkal történő transzfekciója Az E. coll XI 776-nak rekombináns DNS molekulák keverékével történő transzfekcióját úgy végezzük, ahogy ezt J. Van den Berg et al. fenti közleményükben ismertetik. Az összekapcsolt pBR322 rekombináns DNS molekulákat a fentiek szerint előállított, 100 jid, Ca +-na] kezelt E. coli XI 776-hoz adjuk, és az ele^yet jéggel 20 percen át hűtjük, majd 10 percen át 20(3 hőmérsékleten tartjuk, és 0,6 ml tripton táptalajt adunk hozzá. Az elegyet a fentiek szerint kiegészített (100 pg/ml diamino-pimelinsawal, 10 jug/ml nalidixsawal és 10 pg/ml tetraciklinnel) két tripton-agar lemezre visszük. így transzekciós hatásfokként 3,3xl04 kolónia/jug összekapcsolt pBR322 transzfekciós DNS értéket kapunk: a nativ pBR322 3xl04 kolónia/pg értéket ad. Mivel a pBR322 plazmid a tetraciklinnel szembeni rezisztenciáért felelős gént tartalmaz, azok az E. coli gazdaszervezetek, amelyeket az ezt a gént hordozó plazmidok transzformáltak, az előbbi antibiotikumot tartalmazó kultúrában növekedni fognak, míg a nem transzformált baktériumok elpusztulnak. Ily módon tetraciklint tartalmazó kultúrában való növekedés alapján a rekombináns DNS-sel vagy reciklizált vektorral transzformált gazdaszervezeteket elkülönítjük. 37°C hőmérsékleten 48 órás állás után az egyes kolóniákat kiszedjük és 100 pl tripton táptalajban (mely 100 pg/nd diaminopimelinsavat 10 pg/ml nalidixsavat és 10 pg/ml tetraciklint tartalmaz) mikrotiter-lemezek üregeiben szuszpendáljuk (Dynatech). 37°C hőmérsékleten egy éjjelen át inkubáljuk, és mindegyik üregbe 100 pg 40%-os glicerint adunk. A lemezeket -20°C hőmérsékleten tároljuk és 100 000 transzformált E. coli XI776 egyedi kiónjainak sorozatát állítjuk elő. E 100 000 klón az IFN-t termelő leukocitákból származó poli(A) RNS mRNS elegyének részben vagy teljesen megfelelő, különböző rekombináns DNS molekulát tartalmaz (2. ábra). Ezek nagy része csupán egyetlen rekombináns DNS molekulát tartalmaz. Ezek közül a rekombináns DNS molekulák közül csak nagyon kevés vonatkozik az IFN-re. Ezért az IFN-nel kapcsolatos kiónokat megfelelő szkrineléssel el kell különítenünk a többitől. HuIFN-aDNS-t tartalmazó kiónok szkrinelése Az irodalomban több módszer ismert humán leukocita interferon cDNS-t (HuIFN-oDNS-t) tartalmazó bakteriális klón szkrinelésére. Így például RNS szelekciós hibridizáció (Alwine et;al. „Method for Detection of Specific RNAs . . . Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 14, 5350-54/1974), differenciálás hibridizáció [T. P. St. John and R. W. Davis „Isolation Of Galactose-Inducible DNA sequence From Saccharomyces Cerevisiae By Differential Plaque Filter Hybridization”, Cell, 16, 443452. o. (1979), Hoeijmakers et al. „The Isolation of Plasmids Containing DNA Complementary to Messerger RNA for Varjúmt Surface Glycoproteins of Trypanosoma brucci , Gene, 8, 391-417 (ir980)], szintetikus vizsgálattal végzett hibridizáció B. Noyes et al. „Detection And Partial Sequence Analysis Of Gas(fin mRNA By Using An Oligodeoxynucleotic Probe , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 1770-1774, (1979)] vagy a kívánt fehérjét előállító kiónok immunológiai (L. Villa-Kom arofî et 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
