194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 al. fend közleményük) vagy biológiai (A. C. Y. Chang et al. fend közleményük) vizsgálatokkal végzett szkrinelése. A találmányban az RNS szelekciós hibridizációt használjuk, lévén e módszer az IFN-dcDNS-t tartalmazó kiónok elsődleges szkrinelésére a legkényelmesebb és legígéretesebb. A ) RNS szelekciós hibridizáció vizsgálati módszer 1. A kezdeti vizsgálati módszer ismertetése A 2. ábrára visszautalva a rekombináns DNS molekukát a fend klóngyűjteményből származó 512 klón keverékének egy kultúrájából különítjük el (2 klón két keverékét a 2. ábrán mutatjuk be) (A. lépés). Az alábbiakban magyarázatot adunk arra vonatkozóan, hogy miért ezt a telepmennyiséget választjuk. A rekombináns DNS molekulákat elhasítjuk, denaturáljuk és az előbbiekben ismertetett módon előállított INF-amRNS-t tartalmazó leukocita pIi(A)-RNS hez hibridizáljuk (B. lépés). Valamennyi DNS- poli(A)RNS hibridet a nem-hibridizált poli(A)RNS- től elkülönítjük (C. lépés). A hibridekből a poli-(A)RNS-ket visszanyerjük és tisztítjuk (D. lépés). Majd a fentiekben ismertetett módszerrel a kinyert RNS t IFN-amRNS aktivitásra megvizsgáljuk (E. lépés). Ha a rekombináns DNS molekulák elegye tartalmaz olyan rekombináns DNS molekulát, melynek egy inszertált nukleotid szekvenciája poli(A)RNS-ben - a hibridizáció szigorúan meghatározott körülményei között — képes IFN-amRNS-sel hibridizálódni, akkor és csak akkor fog e hibridből az oocitákban IFN-a keletkezését eredményező mRNS felszabadulni, mivel bármilyen más rekombináns DNS-poli(A)RNS hibridből származó mRNS nem eredményezi IFN-a keletkezését. Ha az 512 klónból álló csoport pozitív válaszreakciót eredményezett, így a kiónokat 8. egyenként 64 klónból álló csoportra osztjuk és valamennyi csoportot a fenti módon megvizsgálunk. E vizsgálatot addig folytatjuk, míg - a válaszreakcióért felelős — egyetlen kiónt nem azonosítjuk. Arra vonatkozólag nincs biztosítékunk, hogy az így kiválasztott rekombináns DNS és az ezzel transzformáit bakteriális klón az IFN-Ornak megfelelő teljes IFN-acDNS szekvenciát tartalmazza, vagy hogy e DNS szekvencia ténylegesen kódolja az IFN-CH. Azonban a rekombináns DNS molekulák az IFN-Or -mRNS kódoló-szekvenciával komplementer nukleotid szekvenciák jelentős részét biztosan tartalmazzák. Így a rekonbináns DNS molekulát más rekombináns DNS molekulák és az ezekkel transzformált kiónok gyors szkrinelésének olyan eszközeként használhatjuk fel, melyekkel autentikus és teljes IFN-ómukleotíd kódoló szekvenciát tartalmazó klónkészleteket azonosíthatunk. 2. Elméleti megfontolások A hibridizáció (B. lépés) szempontjából a körülmények kritikusak. A rekombináns DNS molekula, és poli(A)RNS arányát, valamint az abszolút koncentrációkat a reakciósebesség és sztöchiometria figyelembevételével kell megállapítanunk. A helyes értékek kiválasztása nehézségekbe ütközik, minthogy a poli-(A)RNS-bcn az IFN-amRNS arányát nem ismerjük. Megfelelő és szabályozott kinetika biztosítása céljából a rekombináns DNS-ből származó DNS szekvencia koncentrációját olyanra választjuk, hogy a hibridizáció során a becsült IFN-amRNS koncentrációjához képest feleslegben legyen. Az 512 lehetséges különböző rekombináns DNS keverékében egy IFN-anak megfelelő DNS szekvencia (IFN-aR DNS) vagy egyáltalán nem, vagy legalább kb. 1/512 arányban található meg. A rekombináns DNS molekula-keverék koncentrációját, s ezáltal az IFN-aR DNS koncentrációját, a hibridizációs lépésben megfelelő hibridizációs sebességet biztosítva állíthatjuk be. Továbbá, hogy az IFN-aR DNS a reakcióelegyben olyan menynyiségben kell, hogy jelen legyen, hogy elegendő IFN-dmRNS-t kössön meg poli(A)RNS-ből ahhoz, hogy a rekombináns DNS-poli(A)RNS hibridből kapott mRNS oocltákba történő injektálása után lehetővé váljék az IFN-a kimutatása. Ahhoz, hogy az IFN-at a rendelkezésünkre álló módszerekkel kimutathassuk, koncentrációja legalább 100 NE/m] kell hogy legyen. Mivel a két párhuzamossal végzett meghatározásokhoz 0,5 ml-nyi alivot részek szükségesek, az oocitákban 50 NE-nyi IFN-O-t kell előállítanunk. Az előzőekben használt, indukált leukocitákból származó poli(A)RNS az oocitákba történő 1 pg-os injekciót követően kb. 500 NE-nyi IFN-o-t generál. Ezért — a kívánt 50 NE elérése céljából — legalább 0,1 pg poli(A)RNS-t kell injektálnunk. Nyúl globin mRNS-sel és nyúl ßglobin cDNS-klónokkal végzett modell kísérletek szerint az oocitákban a teljesen visszanyert ,35I-globin mRNS a hibridizációs elegyhez adott 125I-globin mRNS re vonatkoztatva kb. 10%, míg a visszanyert mRNS aktivitás kb. 5%. Ezek alapján legalább 0,1/ 0,05 = 2 pg leukocita poli(A)RNS-t kell a hibridizációs vizsgálatban használnunk. Megfelelő biztonsági határok biztosítása céljából vizsgálatonként 12 pg poli(A)RNS-t használunk. A 12 pg poli(A)RNS-ben lévő IFN-amRNS kötéséhez szükséges, rekombináns DNS-ből származó DNS mennyiségét a következőképpen számítjuk ki. A poli(A)RNS IFN-amRNS tartalmát becsüljük. 1 pg poli(A)RNS 500 NE-nyi IFN-qlF-t hoz létre. Az IFN-a fajlagos aktivitása 2x10® és 109 NE/mg fehérje értékek között van. így 500 NE IFN-a 500/(2x10®) = 2,5 . 10'6 mg (2,5 ng) és 500/109 = 5xl0'7 mg (0,5 ng) közötti interferon mennyiségnek felel meg. Az oocitába injektált IFN-ttmRNS mennyisége és a termelt IFN-a mennyisége közötti összefüggés ismeretlen. /3-globin-mRNS esetében mRNS molekulaként kb. 30 fehérje molekula keletkezik egy óra alatt: ez az érték kb. 6-tal egyenlő ß-globin esetén tj. B. Gurdon et al., „Message Stability In Injected Tog Oocytes: Long life Of Mammlian And (FGlo bin Messages”, J. Mol. Biol. 80, 539-51. o. (1973)]. Ha IFN-a esetén átlagos értékként 20-szal, az IFN-a molekulasúlyaként 18 000-rel, valamint az IFN-o -mRNS molekulasúlyaként 330 000-rel számolunk, akkor 24 óra alatt az injektált IFN-amRNS ing-jaira 26 mg (18000/330000x20x24) IFN-a kell, hogy keletkezzék, Amennyiben az IFN-a fajlagos aktivitása 2x10® NE mg (2x209 NE/ng), úgy 1 ngIFN amRNS 26x2x101 = 5,2x10* NE-nyi IFN-ot termel. Ha a fajlagos aktivitás 109 NE mg (10* NE/ng), akkor 2,6x102 * 4 NE-nyi IFN-a keletkezik. Mivel 1 pg leukocita poli(A)RNS 500 NE mennyiségű IFN-o-t eredményez, a fenti feltételezett körülmények között, 1 pg polÍ(A)RNS-ben az IFN-amRNS koncentráció 0,1 ng és 0,02 ng közötti, és az IFN-amRNS koncentrációja a leukocita poli(A)RNS-ben 1 : 10 000 és 1 : 50 000 közötti érték. így 12 pg poü(A)RNS 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
