194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 szennyezések eltávolításának nehézségétől, az expresszió jellemzőitől, mint pl. a start és stop kódonoknak a vektor szekvenciáira vonatkoztatott relatív helyzetétől, valamint — az irodalomban ismert — egyéb faktoroktól. Vektort és egy adott gén szántára megfelelő inszertációs helyet e tényezők mérlegelésével határozzuk meg, minthogy egy bizonyos esetben nem minden tényező játszik egyformán fontos szerepet. Rekontbináns DNS molekula képzése céljából klón-hordozóba vagy vektorba történő Idegen DNS inszertálására több módszer ismeretes, azonban a találmánnyal összhangban elsőként előnyösen Villa-Komaroff és munkatársai fenti közleményében Ismertetett módszert alkalmazzuk, mellyel az 1. ábrán szemléltetünk, olyan módon, hogy egy plazntldot (előnyösen pBR322-t) a választott inszertáció helyére (előnyösen PstI helyre) specifikus restrikciós enzimmel kezelünk és terminális transzferázzal dGMP végeket építünk a végéhez. A dGMP végeket a plazmid-rész 5 terminális részéhez adjuk, abból a célból, hogy a PstI helyet regeneráljuk, továbbá hogy a komplementer végeket hordozó cDNS fragmenshez való hozzákapcsolást biztosítsuk. Hasonló módon, a kettősláncú cDNS-t a 3 terminális részhez történő dCMP végek hozzáadásával hosszabbítjuk meg, így biztosítva a plazmid farokrészhez való hozzákapcsolást. A farokkal ellátott plazmidot és cDNS- t, a cDNS-nek a plazmid megfelelő helyéről történő inszertálása, és a hibrid DNS szétterjedése céljából temperáljuk, majd a farokrészek komplementer jellege lehetővé teszi összekapcsolódásukat (1. ábra). Dy módon a kapott rekombináns DNS-molekula a gént a választott restrikciós helynél hordozza (1. ábra).. Nyilvánvalóan, a DNS szekvenciák klón-hordozókba történő Inszertálásával végbemenő rekombináns DNS molekulák képzésére alkalmas más ismert módszer is alkalmas. így például közvetlen ligációt, szintetikus összekapcsolókat exonukleáz- és polimerázkapcsolt javító-(repair)-reakciók utáni ligációt vagy egy DNS lánc DNS polimerázzal történő meghosszabbítását és egy megfelelő egyláncú templátot majd ligációt használunk. A nukleotid szekvenciák vagy cDNS fragmens, melyet a klón-hordozó megfelelő helyére inszertálunk, olyan nukleotidokat is magukba foglalhatnak, melyek a kívánt polipeptidnek megfelelő aktuális szerkezeti génnek nem részei, vagy lehetséges, hogy a kívánt polipeptidnek megfelelő teljes szerkezeti génnek csak egy fragmensét tartalmazzák. Csak az szükséges, hogy bármilyen DNS szekvenciát is inszertálunk, a transzformált gazdaszervezet a HuIFN-a biológiai vagy immunológiai hatásával rendelkező polipeptidet állítson elő, vagy hogy magát a DNS szekvenciát a HuIFN-a immunológiai vagy biológiai hatásával rendelkező polipeptideket kódoló DNS szekvenciákat tartalmazó kiónok kiválasztására hibridizációs vizsgálati alanyként használjuk. Az idegen gént tartalmazó klón-hordozóval vagy vektorral egy gazdaszervezetet alakítunk át abból a célból, hogy a gazdaszervezet a hibrid DNS által kódolt fehérjét vagy fehérje-részt állítson elő. A megfelelő gazdaszervezet kiválasztásánál az Irodalomban ismertetett számos tényezőt kell figyelembe vennünk. így például a választott vektorral való összeférhetőségét, a hibrid plazmid által kódolt fehérjék toxieitását, a kívánt fehérje elkülönítését, az expresszió jellemzőit, a biológiai biztonságot és a költségeket. Meg kell határoznunk e tényezők egyensúlyát, annak figyelembevételével, hogy nem mindegyik gazdaszervezet alkalmas egyformán egy sajátságos rekombináns DNS molekula expressziójára. A találmányban előnyösen kezdeti klón-hordozóként pBR322 bakteriális plazmidot és kezdeti restrikciós endonukleáz helyként az ebben lévő PstI helyet használjuk (1. ábra) A plazmid (molekulasúlya kb. 2,6 megadalton) a kisebb plazmidok körébe sorolható, és ampicDlinnel (Amp-vel), valamint tetraciklinnel (Tet-tel) szemben rezisztens géneket tartalmaz. E plazmid valamennyi jellemzőit ismerjük [F. Bolivár és társai „Construction And Characterization Of New Cjoning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System , Gene, 95, 113. o. (1977), J. G. Sutcliffe, ,,pBR322 Restriction Map Derived From The DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long , Nucleic Acids Research, 5, 2721—28. o. (1978)]. A DNS-termék e helyre történő inszertálásával az előzőekben előállított DNS termékben jelenlévő DNS gének vagy fragmensek valamelyikét tartalmazó nagyszámú bakteriális kiónhoz jutunk. Azonban e kiónok közül csak nagyon kevés tartalmaz IFN-a-géneket vagy ennek fragmenseit. Előnyösen kezdeti klónozás céljaira gazdaszervezetként E. coli HB 101-t használunk. Az 1 516 458. sz. brit szabadalmi leírásban az E. coll 1776 jelű gazdaszervezettel végzett kísérleteket ismertetik. E gazdaszervezetet az American Type Culture Collection-ben (Rockville, Maryland USA), ATCC No. 31244 azonosítási számon jegyezték be. 1. Pstl-gyel hasított, dGMP-vel meghosszabbított pBR322 előállítása 20 /ig pBR322 plazmidot 21 egységnyi PstI endonukleázzal (MRE Porton Downs vagy New England Biolabs) 150 jul 10 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH = 7,5), 6 mmól/liter MgCl2-t 50 mmól/liter NaCl-t, 6 mmól/liter 2-merkapto-etanoll és 200 mgjfA szarvasmarha szérlum albumint (BSA-t, Calbiochem) tartalmazó rendszerben emésztünk. 37°C-on 2 órás állást követően az elegyet 1 térfogatrész 1 : 1 arányú fenol-kloroform eleggyel, majd 1 térfogatrész éténél extraháljuk és etanollal kicsapjuk. 100 mmól/liter nátrium-kakodilátot (pH = 7,2), 10 mmól/liter NaH2P04-et, 5 mmól/liter MgCl2-t, 1 mmól/liter dGTP-t, 50 fJgJivl BSA-t és fjg DNS- enként 3—6 egység TdT-t (terminális deoxinukleotidil-transzferázt) melyet F. J. Bollum módszere szerint tisztítunk [Deoxynucleotítjp polymerizing Enzymes From Calf Thymus Gland in Methods in Enzymology, (L. Grossman és K. Moldave, kiadó) Academic Press, New York, 128, 591—611 o. (1968)] - tartalmazó 328 /iá-térfogatú reakcióelegyben a TdT segítségével (melyet az előzőek szerinti módon tisztítunk) homopolimer dGMP farokrészeket adunk a hasított plazmidhoz (1. ábra). Ezután 37°C hőmérsékleten 20 percen át inkubáljuk, 10 mmólos koncentráció eléréséig EDTA-t adunk hozzá és a reakdóelegyet a fentiekkel azonos módon extraháljuk, majd TNE pufíérrel szemben 2 napon át dializáljuk. 2. dCMP-vel meghosszabbított DNS előállítása Kettősláncú DNS-t standard módszerek alkalmazásával (pl. Vüla-Komaroff fenti közleményében Is 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
