194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 2 egyedi fehérjét kódoló génekből csak azok töredékét hordozó rekomblnáns DNS molekulákat tartalmaznak. E töredékeket tartalmazó kiónok jelenléte tovább nehezíti a végső klón-szkrlnelést. A különböző egyláncú cDNS-ek méretét egy alikvot rész alkállkus 2%-os agaróz gélen — elektrolitként 30 mmól/llter NaOH-t, 2 mmól/llter EDTA-t tartalmazó oldatot használunk — végzett elektroforézlssel határozzuk meg. [M. W. McDonell és társai, „Analysis Of Restriction Fragments Of T7 DNA And Determination Of Molecular Weights^BY Electrophoresis In Neutral And Alkaline Gels”, J. Mol. Biol. 110, 119—46. o. (1977)1. Méret-jelzőként 600-1000 nukleotid hosszúságú SÎPDNS-t és fragmen seit alkalmazzuk. Kettősláncú cDNS előállítása DNS-polimeráz I-gyei történő kezeléssel az egyláncú cDNS-t kettősláncúvá alakíthatjuk át. [T. Maniatis és társai, Amplification And Characterization Of A ß-Globin Gene Synthesized In Vitro , Cell, 8, 162-82. o. (1976)]. A fenti módon kapott cDNS-t 200 ß vízben feloldjuk, 2 percen át 10Ö°C hőmérsékleten tartjuk, és 500 ß—0,1 mól/liter kálium-foszfát puffert (pH = 6,9), 10 mmól/liter Mg-Cl2-t, 10 mmól/liter DTT-t (Calbiochem), 1-1-1 mmól/liter dATP-t (Merck), dGTP-t (Schwarz) és dCTP-t (Laevosan), 1 mmól/liter 3H-dTTP-t (NEN, 100 000 cpm/nmól fajlagos aktivitású) és 150 egység/ ml E. coli DNS-polimeráz l-t (Boehringer-Mannheim) tartalmazó — oldatban 6,5 órán át 15°C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 0,5 mólos EDTA-t és 20%-os SDS-t annyit adunk hozzá, hogy EDTA-ra nézve 10 mmólos Ül. SDS-re nézve 0,1%-os oldatot kapjunk. Ezután a reakcióelegyet 500 jul fenollal extraháljuk, majd a fenolos fázist 250 ß 20 mmól/liter Tiisz-HCl-t (pH = 7,5), és 5 mmól/liter EDTA-t (TE puffer) tartalmazó oldattal extraháljuk. A két vizes fázist egyesítjük, és 5 ml-es Sephadex G-100-as oszlopon, az előzőekben ismerteit körülmények között kromatografáljuk. 3 mólos nátrium-acetátból annyit adunk hozzá, hogy nátrium-acetátra nézve 0,3 mólos legyen, majd 2,5-szeres térfogatú etanollal választjuk le a DNS-t, így 13 jug DNS-t kapunk. A kapott DNS-t Sj-nukleázzal [melyet R. C. Wiegand és társai., „Specificity Of The S, Nuclease From Aspergillus oryzae”, J. Biol. Chem., 250, 8848-55 o. (1975) szerint állítunk elő] kezeljük. A kicsapott DNS-t 250 ß Sj-pufferben (0,2 mól/ liter NaCl-t, 50 mmól/liter nátrium-acetátot (pH = 4,5), 10 mmól/liter cink-szulfátot tartalmaz) feloldjuk és 37°C-on 30 percen át tartjuk. 0,1%-os SDS és 5 mmólos EDTA koncentrációnak megfelelő SDS-t, JQ1. EDTA-t adunk hozzá, majd 250 ß fenollal extrahaljuk. A fenolos fázist 100 ß TE pufferrel mossuk, és az egyesített vizes fázisokat TNE formájú Sephadex G-100 (Pharmacia) oszlopon kromatografáljuk 0,3 ml/perc eluátum sebesség mellett. 0,1 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk, s mindegyik frakció Cerenkov sugárzását meghatározzuk. Etanollal és nátrium-acetáttal végzett kicsapást követően 8 /tg kettősláncú cDNS-t kapunk. Hangsúlyoznunk kell ismételten, hogy a fenti módon előállított kettősláncú cDNS nagyszámú különböző cDNS-ek és fragmenseik keveréke, melyek közül csak nagyon kevés HuIFN-acDNS vagy ennek fragmense (1. ábra). Kettősldncú DNS klónozása A fentiekben Ismertetett módon előállított kettősláncú cDNS klónozására számos különböző gazdaszervezet/klón-hordozó kombinációt használhatunk. így például klón-hordozóként kromoszómális szegmenseket, nem-kromoszómális és szintetikus DNS szekvenciákat, mint pl. különböző ismert bakteriális plazmidokat, pl. E coliból származó plazmidokat beleértve col El-t, pCRl-t, pBR322-t és ezek származékait — különböző gazdaszervezetplazmidokat — például RP4-t, fág DNS-t, mint például a A-fág számos származékát, például NM 989-t és fág DNS-ek és plazmidok kombinációjából kapott vektorokat, pl. fág DNS vagy más expressziót szabályozó szekvencia felhasználására alkalmas módosított plazmidokat, vagy élesztő plazmidokat, mint pl. 2 p-os plazmidot vagy származékait, használunk. Gazdaszervezetként bakteriális gazdaszervezeteket, mint pl. E. coli törzseket, pl. E. coli HB 101-t, E. coli X1776-ot, E. coli X2282-t, E. coli MRCl-t, Pseudomonas törzseket, Bacillus subtilist, Bacillus stearotermophilust és más egyéb bacilust, élesztőket és más gombákat, állati és növényi gazdaszervezeteket, például állati (és emberi) vagy növényi sejtkultúrákat vagy más gazdaszervezeteket használunk. Nyilvánvalóan.nem mindegyik gazdaszervezet/vektor kombináció egyformán hatásos. A megfelelő gazdaszerveket/klón-hordozó kombinációs kiválasztását ismert elvek alapján végezzük, a találmány körén belül maradva. Továbbá, minden egyedi klón-hordozón belül a kettősszálú DNS inszertálására alkalmas különböző helyeket választhatunk ki, amelyek rendszerint az ezeket hasító restrikciós enzimekkel jellemezhetők. így pl. pBR322 esetén a PstI hely a /3-laktamáz-génben, az ennek a fehérjének 181. és 182. aminosav komponensét kódoló nukleotid triplettek között helyezkedik el. Villa-Komaroff és munkatársai (fenti közleményükben) ezt a részt használták fel patkány proinzulin antigén determinánsainak tulajdonságait mutató fehérje molekula szintézisében. A két Hindii endonukleáz felismerési hely egyike a 101. és 102. aminosavakat kódoló triplettek között, a Taq helyek egyike pedig a pBR322-ben a ß-laktamáz 45. aminosavkomponenséj kódoló triplettnél található. Hasonló e plazmidban az EcoRI és Pvull helyek bármelyik kód-területen kívül helyezkednek el, így az EcoRI hely a tetracfldinnel Ül. ampicIIUnnel szembeni rezisztenciát kódoló gének között helyezkedik el. Itakura és munkatársai, valamint Goeddel és munkatársai rekomblnáns szintetikus munkájukban ezt a részt használták fel (fenti közlemények). E részek az irodalomban jól ismertek. Nyilvánvaló, hogy egy a találmány céljainak megfelelő klón-hordozó nem szükséges, hogy a választott DNS inszertálására megfelelő restrikciós endonukleáz résszel rendelkezzék, hanem ehelyett a hordozó más módon kapcsolódhat a fragmenshez. A vektor vagy klón-hordozó, és különösen az a hely, amelyben a rekomblnáns DNS molekulát képező kiválasztott DNS fragmens kötődik, különböző faktoroktól függ, például az egyedi restrikciós enzimre érzékeny helyek számától, a kódolt fehérjétől, a kívánt fehérjének a gazdasejt enzimjeivel történő prototípus lebontásával szembeni érzékenységétől, a kívánt fehérje mellől a gazdasejt fehérje 194 305 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
