194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 nológlal vagy biológiai hatásával reuuv,KCző, Z-pBR322(Pst)/HclF-SN35-tel (az ábrán SN35-tel jelöljük) transzformált gazdasejt által termelt polipeptiu előállítási liozam - növelésének egy további lehetőségét mutatjuk be. A hibrid plazmidot Bsplgycl a szokásos módon hasítjuk. A restrikciós enzim melegítéssel történő inaktiválása után 65°C-on 30 percen át az elegyet 50 mmólos Trisz-HCl-lel (ph = 8) kezeljük, majd melegítjük (37°C-on 30 percen át). Fenollal és éterrel végzett extrakciót követően a legnagyobb alcDNS fragmenst alacsony hőmérsékleten agaróz gélen (0,8%) elkülönítjük és Hindlll kapcsolókat kötünk hozzá. Ezután a módosított fragmenst HindlII-mal hasított HS-pBR-322(Eco)/lacUV5-l 50 („LAC-150”)* plazmidhoz kapcsoljuk úgy, hogy a fragmenst tartalmazó egyenként kb. 20 /ü-es géldarabkákat 65°C-on megolvasztjuk, majd 37°C hőmérsékletre hűtiük és 20 egység/ ß T4DNS ligázt adunk hozzá. 15*C hőmérsékleten való 16 órás állás után a megszilárdult gélben a ligáció végbemegy. 0,1 térfogatrész 100 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH = 7,5), 100 mmólAiter CaCl^-t, 100 mmól/liter MgCl^-t tartalmazó oldat hozzáadása után 5 percen át 65 C hőmérsékleten melegítjük, majd 37 Ç hőmérsékletre hűtjük. A mintákkal ezután Ca1 -na! kezelt E. coli HBlOl-t transzformálunk, 0°C-on 20 percen át inkubáljuk, majd 42°C-on 1 percen át és 20°C-on 10 percen át melegítjük. 1 mól tripton táptalaj hozzáadását követően 37*C hőmérsékleten 60 percen át inkubáljuk, és ampicfllint tartalmazó agar lemezekre visszük. E kultúrákból a plazmid DNS-t a fenU módon elkülönítjük, és restrikciós analízissel az 5 végével LAC fragmensekhez kapcsolódó INF-al inszertet tartalmazó hibrid plazmidot azoonosítjuk. Ezután a plazmidot EcoRI- gyel a szokásos módon hasítjuk és BAL-31 exonukleázzal (0,06 egység/ml) 30°C-on 2 4 percen át emésztjük, a LAC fragmens EcoRI túlérő farokaészének eltávolítása, és a ß-galaktozidáz-kódoló szegmens rövidítése céljából. Abból a célból, hogy a kezelt plazmid a teljes IFNal-kód szekvenciát tartalmazza, a plazmidot a szokásos módon BglII- vel hasítjuk, az előbbi módon feldolgozzuk és a legnagyobb fragmenst agaróz gélen (0,8%) elkülönítjük. E fragmenst Z-pBR322(Pst)/HclF-SN-35-ből származó Bspl-Bgbll fragmcnssel kapcsoljuk, és a kapott hibrid plazmiddal - a fenti módon — E. coli HBlOl-t transzformálunk. A transzformált telepeket az IFN hatás szempontjából szkrineljük és a nagy értékű IFN hatással rendelkező kiónt elkülönítjük. E kiónt E. coll HB101(C8-IFN-el), hibrid plazmidját pedig C8-IFN-al szimbólumokkal jelöljük. A 08-lFN-al DNS szekvencia-analízise azt bizonyítja, hogy az iniciátor troplettet követő kód-szekvencia a 0-galaktozidáz első hét aminosav komponensét, az összekapcsolás révén keletkező Pro maradékot, az IFN-al jelszekvencia 16-23 aminosav komponensét és az IFN-al (SN 35) szekvenciát határozza meg. C8-IFN-al hibrid plazmiddal transzformált E. coli minisejt törzsek (DS410) literenként kb. 50 millió egység IFN-t vagy kb. kétezer-ötszázszor több, a HuIFN immunológiai vagy biológiai hatásával rendelkező polipeptidet termelnek a módosítatlan Z- pBR322(Pst)/Hif-SN35-tel transzformált minisejtekhez képest. A C8-lFN-al plazmiddal termelt polipeptid aminosav szekvenciája megerősíti, hogy a termék olyan összekapcsolt fehérje, mely a ß-galaktozidázból származó hét aminosavat, az összekapcsolódásból kialakuló aminosavat és az IFN-al-gyei összekapcsolt IFN-al szignálszekvencia 16-23 aminosav komponensét tartalmazza. *E plazmid, HaeIII-202. b.p. fragmenst tartalmaz, amelyet a 3 -végen EcoRI kapcsoló határol. (W. Gilbert et al., „Lactose Operator Sequences And The Action Of Lac Repressor In Protein Ligand Interactions, H. Sund és G. Blauer, kiadók (Berlin, Walter de Gruyter), 193-206. o. és K. Backmann et al., „Maximizint Gene Expression On A Plasmid Using Recombination In Vitro ’, Cell, 13, 65-71. o. (1978). A következőkben néhány példát mutatunk be a protein-termelés találmány szerinti módon történő javítására más IFN-aformákkal kapcsolatban. Hibrid plazmidokkal transzfo j It E. coli által termelt interferon aktivitás sajátsuj t 1. Az IFN-a aktivitás tripszinnel szembeni érzékenysége Egyenként 5Ó ßl-es autentikus HuIFN-a mintákat (1,2 x 10® egység/ml fajlagos aktivitású, 50 egység, fentiekben ismertetett E. coli HB101 (Z-pKT-287(Pst)/HcIF-2h-AH6) („Hif-287-6” extraktumok) (200 egység/ml, 10 egység) és E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35) („Hif-35 extraktumok) (1000 egység/ml, 50 egység) S 100 extraktunrokat az alábbiakban részletezett mennyiségű tripszinnel 30 percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. Mivel az SÍ00 extraktumok magas fejérje tartalmúak, míg a HuIFN-a nem, így a HuIFN-a és a kontroll Hif--32 SÍ00 extraktum keverékét párhuzamosan vizsgáljuk. I FN-a készítmény Tripszin IFNa ak(Mg) tivitás HuIFN-a 50 egység 50 ß 0 (egységekben) 50 , Hif-32 S 100 extrák0,1 50 ban) 1 50 10 5 50 0 Hif-287-6 S100 0 15 extraktum • 0,1 15 (10 egység) 1 5 10 1 50 0 Tehát az extraktumban lévő IFN-a trlpszinre és így fehérjére érzékeny. Hif-35 SÍ00 extraktum 0 30 (50 egység) 0,1 20 1 20 10 2 50 0 2. Sephadex G-100-on végzett kromatográfia jellemzése Hif-35 extraktumot (1 ml) és E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN32) S100 extraktumát („Füf-32” extraktumok) Sephadex G-100 oszlopon 4°C hőmérsékleten 50 mmól/literes K-foszfát pufferben (pH = 7,4) kromatografáljuk. Belső jelzőként 0,2 mg citokróm c-t adunk hozzá. 2 ml/óra kifolyási sebességgel 1,0 ml-es frakciókat gyűjtünk. Ezután 280 nm és 405 nm hullámhosszokon (citokróm c) az abszorbanciát, és az IFN-a aktivitást megha-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 23
