194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 tározzuk. A 7. ábrán bemutatott módon a Hif-35 extrakturnok IFN-a aktivitása a citokróm c előtt, kb. 0,45-ös kj-j értékkel jellemezhetően eluálódik. Ily módon a szubsztancia látszólagos molekula súlya kb. 20 000 és 30 000 közötti érték*, a Hif-32 kontrol] extraktum frakciók esetén aktivitást nem lehet kimutatni. * A nuklcotid szekvencia alapján, feltételezve, hogy karboxi-terminális reakció nem megy végbe, 19338-t kapunk. 3. Hif-35 és Hif-287-6 interferon hatásának humán leukocita interferon elleni antitesttel történő gátlása. 1,2 x 10* N.E./mg. fajlagos aktivitású HulFN-a-t és Hif-35/Hif-287-6 S1Ö0 extraktumokat 450000 egység/inl fajlagos aktivitású HuIFN-a elleni birka antirszérum (K. Cantell által 1976. február 24-én előállított készítmény) különböző hígításával 100 ß módosított Eagle-féle táp közegben (MÉM) 10% borjú szérummal 37°C hőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk és 45 7Í-t az IFN-a hatás szempontjából a citopatikus hatás csökkentés alapján megvizsgálunk (Maga az antitest nem okoz citopatikus hatást): IFN-a preparátum Anti-leukoci- Maradék (egységekben) ta-interferon IFN-a akantitest (egy- tivitás ségekben) (N.E.-ben) IFN-q 0 5 (10) 0,18 ~ 0,5 9 <0,1 450 <0,1 Hif-35 extraktum 0 15 (25) 0,18 15 9 <0,1 450 <0,1 Hif-287-6 extraktum 0 15 (25) 0,18 15 9 <0,1 450 <0,1 0 <0,1 450 <0,1 Annak illusztrálására, hogy az antitest hatás nem nem-specifikus hatás következménye, mint pl. a proteolitikus lebomlás, egér interferon-rendszerrel hasonló kísérletet végeztünk: IFN preparátum Anti-leukoci- IFN-a ak(egységekben) ta-interferon tivitás antitest (egység/ml(egység/ml- -ben (egér -ben rendszer) egér preparátum 4500 100 (100 egység) 90 100 18 100 Tehát a HuIFN-a ellenes antitestek specifikusan gátolják HcIF-2h DNS szekvenciát tartalmazó meghatározott rekombináns DNS molekulákkal transzformált E. coliban termelt polipeptidek IFN-a aktivitását. Az antitest E. coliban termelt IFN-Orval szemben kisebb affinitása az utóbbi és a természetes HuIFN-a közötti szerkezeti különbségeket tükrözheti, így például a szénhidrát rész hiányát, szignál szekvencia jelenlétét, vagy a (31 aktamáz szekvencia résszel történő összekapcsolódást. 4. A Hif-35 és Hif-287-6 extrakturnok egérsejteken megnyilvánuló csökkent aktivitása. Humán CCL23 sejteket vagy egér L929 sejteket E. coli extraktumokkal, HuIFN-a-val (K. Cantell által előállított 1,2 x 10® egység/mg fajlagos aktivitású preparátum) vagy egér IFN-nel (N. I. H. standard) kezeljük, majd vírusokkal fertőzzük (humán sejtek esetén Mengo vírussal, míg az egér sejtek esetén VSV vírussal), és az IFN^i aktivitást a citopatikus hatás csökkentése alapján meghatározzuk. Minta IFN-aktivitás (egység. egér — interferon (120 egység/ml) ember ml) egér Hif-35 extrakturnok — 120 100 13 1000 120 Hif-287-6 extrakturnok 30 4 300 40 HulFN-a (100 egység/ml) 100 4 HuIFN-a ( 1000 egység/ml) 1000 40 A fenti eredmények arra utalnak, hogy a Hif-35 és Hif-287-6 extrakturnok a humán sejtekre védőhatást gyakorolnak, míg az egér sejtekre csak enyhe hatást (~l-%) gyakorolnak, miként az a humán interferonra jellemző. 5. Néhány sejt-funkcióra gyakorolt hatás E. coli HB101 (Z-pBR3 22(Pst)/Hif-SN35-AHL6) extrakturnok és autentikus IFN néhány sejtfunkcióra gyakorolt hatását hasonlítjuk össze. Az E. coliban termelt IFN-a a természetes IFN-a következő sajátságaival rendelkezik: 1) a humán limfociták természetes ölő aktivitását növeli, 2) növeli az antitest-függő sejt által szabályozott citotoxicitást, 3) az antigén- és mitogén-indukált leukocita migráció gátlást elnyomja és 4) az IFN-érzékeny Burkitt limfóma sejtek növekedését gátolja. Az E. coliban szintetizálódott IFN-a fenti tulajdonságai a humán tumorok és rákok elleni hatásosságának lehető égét vetítik előre. 6. Az amino-terminális szekvencia nélküli IFN-a hatása Az amino-terminális szekvenciák nélküli IFN-ctrt — mely az IFN hatásával összeegyeztethető aktivitású — E. coliban szintén előállíthatjuk. A megfelelő rekombináns DNS molekula előállítása céljából a fenti Hif-2h plazmidot EcoRI-gyel és BamHI-gyel részlegesen emésztjük, az IFN-al-t kódoló szekvenciát tartalmazó fragmenst agaróz gélen elkülönítjük tés Hif-SN35 plazmid - melynek a hibrid inszert 3’ végéhez csatlakozó Pst I helye, a Hif-2hhoz viszonyítva (1. fentiekben) hiányzik - EcoRI) (BamHI-gyel végzett restrikciójával kapott nem IFN-al-t kódoló szekvenciával kombináljuk. A kapott plazmidot az IFN-al amino-terminállsát kódoló szekvencia eltávolítása céljából Pst I/BglII-vel hasítjuk. Helyére Hif-2h plazmid PvuII-vel való emésztésvei, Bal exonukleázzal történő kezeléssel, PstI kapcsoló hozzákötésével és BglII-vc] történő restrikcióval előállított IFN-al fragmensek sorozatát inszertáljuk. Ily módon a kapott plazmidok az IFN-eü-t kódoló szekvenciák oly sorozatát tartalmazzák, melyekből az amino-terminális szekvenciák különböző arányban hiányoznak. E plazmidok közül az egyiket, nevezetesen a 2H-M8 plazmidot Pstl-gyel emésztjük és nuk-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 24
