194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 Azonban bármilyen fehérje keletkezik is, az IFN Immunológiai és biológiai hatásával rendelkezik és így számunkra hasznos. A leglényegesebb, hogy a fehérje hatékonysága azt demonstrálja, hogy az ezt kódoló DNS szekvenciát — a vázolt módon — más a HuIFN-anak megfelelő DNS szekvenciákhoz hasonlók kiválasztására és az érett interferont vagy annak más változatait expresszáló szekvenciák szerkezeti alapjának megállapítására vagy az egyedi expresszált fehérje hozamának javítására rutinszerűen alkalmazhatjuk. *Az IFN hatás elvesztése nélkül háromezer liter vagy ennél nagyobb IFN-a kultúrákat tenyészthetünk. **A fenti expresszió a penicillináz expresszióját szabályozó szekvencia irányítása alatti gének által termelt interferont tükrözheti. A fehérje hozamát két fő tényező határozza meg: a sejten belül génjei másolatának száma és e gén-másolatok átírásának és lefordításának hatásfoka. Az átírás és lefordítás (melyek együttesen foglalják magukba az expressziót) hatásfoka viszont a kívánt kódoló szekvencia előtt szokásosan jelenlévő nukleotid szekvenciától függ. E nukleotid szekvenciát vagy expressziót szabályozó szekvenciák, többek között, azt a helyet határozzák meg, amelynél az RNS polimeráz kölcsönhatásba lépve iniciálja az átírást (promotor szekvencia) és amelynél a riboszómák kötődnek és a mRNS- sel (az átírás termékével) kapcsolatba kerülve iniciálják a lefordítását. Nem mindegyik expressziót szabályozó szekvencia funkciója egyforma hatékonyságú. így célszerű, ha a kívánt fehérjét kódoló specifikus szekvenciákat a csatlakozó nukleotid szekvenciáktól elkülönítjük és helyettük - az expresszió kedvezőbb hozama elérése céljából — más ismert expressziét szabályozó szekvenciákkal kapcsoljuk össze, így az újonnan felépített DNS fragmenst több példányban előforduló plazmidba vagy bakteriofágba inszcrtálhatjuk, abból a célból, hogy a sejten belül a gén-másolatok számát növeljük és így expressziált fehérje hozamát tovább növeljük. A fentiekben ismertettt különböző expressziót szabályozó szekvenciákat használhatunk, melyek az operátor, promotor, az E. coli laktóz operonjának (az ún. lac rendszernek) riboszómát kötő és azzal kölcsönhatásba lépő szekvenciáit (beleértve például a Shine-Dalgarno szekvenciákat is), az E. coli triptofán-szintetá^ rendszerének megfelelő szekvenciákat, „trp rendszer a X-fág fő operátor és promoter területeit (O^Pj és O^P^-t), a fd-fág burkoló fehérjét szabályozó területeket vagy más, a prokariota vagy cukarióta sejtek és vírusaik génjeinek expresszióját szabályozó szekvenciákat foglalják magukba. Ezért egy egyedi polipeptid megfelelő gazdaszervezetben történő előállítási hozamának megjavítása céljából úgy járunk el, hogy az adott polipeptidet kódoló gént a fenti módon előállítjuk, és az ezt tartalmazó rekombináns DNS molekulából elkülönítjük, majd egy rekombináns DNS molekulába az előbbi expressziót szabályozó szekvenciájához közelebb vagy a fenti expressziót szabályozó szekvenciák egyikének irányításával ismét beépítjük. E módszerek az irodalomban ismeretesek. A kívánt termékek celluláris hozamának további növelése a sejtben hasznosítható gének számának növelésétől függ. Ezt például a fentiekben ismerteit módon konstruált rekombináns DNS molekulák X (NM989) temperált bakteriofágokba (N. E. Murray és munkatársai, „Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4”, J. Molec. Biol. 132, 493-505) történő inszertálásával, legegyszerűbben a plazmid restrikciós enzimmel történő emésztésével, a kapott lineáris molekula restriktált X klón hordozóval [pl. N. E. Murray et al. által ismertetett „Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Recombinants” Molec gen. Genet 150, 53-61. o. (1977) és N. E. Murray et al., „Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4’, J. Mol. Biol., 132, 493- 505. o. (1979)] való összekeverésével, majd az így kapott rekombináns DNS molekula DNS ligázzal történő inkubációjával valósíthatjuk meg. Ezután a kívánt rekombináns fajokat kiválasztjuk és az E. coli törzshöz tartozó gazdaszervezetet lizogenizáljuk. Áz előnyösen X klón-hordozók tartalmaznak a cl repressziós génben hőmérsékletérzékeny, az S génben szuppressziós mutációkat — melyek terméke a gazdasejt feloldásához szükséges —, valamint E gént — melynek terméke a vírus fő burkoló fehérjéje. E rendszerrel a lizogén sejteket 32°C-on tenyésztjük, majd a profág kivágása céljából 45°C hőmérséklet re melegítjük. A 37 C hőmérsékleten hosszabb ideig történő tenyésztés a fehérje termelését eredményezi, amely a sejteken belül marad, minthogy közönséges körülmények között a fág-gén termékek ezeket nem oldják fel, és mivel a fág-gén inszert nincs beburkolva, a további transzkripció számára hozzáférhető marad. Ezután a sejtek mesterséges feloldásával a kívánt terméket nagy hozammal kapjuk. A fentiekben ismertetett módon Z PBR322(Pst)-/HcIF-SN35 tel transzformált gazdaszervezetek segítségével kapott, a humán leukocita interferon biológiai és immunológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptid hozamának növelése céljából elsőként a hibridben lévő DNS inszert restrikciós térképét határozzuk meg. E restrikciós térkép azt szemlélteti, hogy — a Hrf-2h val összehasonlítva - a Hif-SN35-ben a 3’ vég melletti PstI hely hiányzik, a szignál szekvencia 7-es konodig (beleértve ezt is) tartó része kimarad, és a szignál szekvenciában az Avail hely helyett Bspl hely található. így valószínűleg, a Hif-SN35 a Hif-2h polimorf és allelikus változata. A Hif-SN35 plazmidot Pstl-gyel felnyitjuk és a kapott DNS szálat a szokásos módszerekkel mindkét végén visszaemésztjük, Lac-Alu fragmenst (1. alábbiakban) inszertálunk ide, majd a plazmidot ismét bezárjuk. A Z-pBR322(Pst)fHcIF-SN3-AHL6-ként szimbolizált, módosított plazmid aktuális szerkezetét, és az E. coliban keletkező fehérje amino terminálisán az aminosav szekvenciát meghatározzuk. E szerkezet nukleotid szekvenciája azt bizonyítja, hogy a LACAlu fragmens az IFN-al(SN35) első aminosav részétől messzebb lévő aminosavhoz kapcsolódva helyezkedik el. Az E. coliban keletkező fehérje aminoterminálls részének aminosav szekvenciája arra utal, hogy olyan összekapcsolt fehérje keletkezik, amelyben az lFN-al(SN35) szekvenciához hat aminosav kapcsolódik. A módosított plazmiddal transzformált gazdaszervezetek kb. százszor több, a humán leukocita interferon immunológiai és biológiai hatásával rendelkező, polipeptidet állítanak elő, mint a módosítás nélküli Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35-tel transzformáltak. A 25. ábrán a humán leukocita interferon immu-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 22
