194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 rendszerben összekeverünk, és 0,1 egységnyi T« DNS llgázzal (New England Blolabs) 16 órán át 10°C-on inkubáljuk. így az Z pBR322 (Pst) /HcIF-2b, Z-pKT279(Pstl) /HcIF-2h, Z-pKT280(Pst) /HcIF-2h és Z-pKT287(Pst) /HcIF-2h reko.nbináns DNS molekulákat kapjuk. E. coll HBlOl-t e rekomblnáns DNS mindegyikével transzformáljuk, és a transzformáit telepeket tctraciklint tartalmazó agar lemezen a fenti módon kiválogatjuk. Mivel a transzformált baktériumok tetraciklin-rezisztens kiónjai újradklizált vektort Is tartalmazhatnak, a bakteriális telepek mindegyikét Millipore szűrőkön tenyésztjük, és a 3íP-vel jelzett Híf-4c fragmenssel hibrídizált telepeket a fenti módon azonosítjuk és válogatjuk. E törzseket a következőképpen jelöljük: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h- AH 1 ) - (-AH3)-ig, E. coli HB101 (Z-pKT279)Pst)/HcIF-2h-AHl) - (-AH8)-ig, E. coli HB101 (Z-pKT280(Pst)JHcIF-2h-AHl) - (-AH8)-ig, E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HclF-2h-AHl) - (—AH8). A fenti törzsek extraktumait, úgyszintén Z-pBR322(Psti)/HuIF-SNl-től 95-ig extraktumait az IFN-a hatás vizsgálata céljából teszteljük. A bakté riumokat rögzített fázisú Tripton táptalajon tenyésztjük, összegyűjtésük után 1)20 térfogatrész (a kultúra térfogatára vonatkoztatottan) 50 mmól/ liter Trisz-HCl-t (pH = 8) és 30 mmól/litcr NaCl-t tartalmazó oldattal mossuk, majd kifagyasztjuk. Felengedés után a sejteket az előbbi puffer alábbiakban megadott térfogatában újraszuszpendáljuk, és 1 mg/ml mennyiségben lizozimot adunk hozzá. Ez után 0°C hőmérsékleten 60 percen át tartjuk, majd etanol-szárazjég hűtőkeverékben kifagyasztjuk, 37 C hőmérsékleten ezt a műveletet ötször megismételjük, majd 10 percen át 12000 fordulat/perc fordulatszámmal GSA Sorvall típusú rotorral centrifugáljuk. Néhány esetben a felülúszót (S30) Spinco 65 típusú rotorral 100 00 x g-vel centrifugáljuk és a' felüE úszót (S100) visszanyerjük. E felúlúszókat a citopatikus hatás csökkentése alapján (1. kísérlet az IFN-a hatás vizsgálata céljából szkrineljük. Az 1. kísérletben pozitív eredményt adó telepeket ismét megvizsgáljuk, úgyszintén 49 kiónt a fentiekben ismerteti Z-pBR322/HcIF-SN-l -SN-95 egyedekből, de alacsonyabb hígításban (2. kísérlet). Az extrák tűm forrása: E. coli HB 101-t transzformálva a következőkkel: 1. Kísérlet* Prepa- IFN-e rátum aktivitás (N.E./ ml) Z pBR322(Pst)/HcIF 2h S30 ? Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h-AH-l-3-ig S30 ? Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AH-l-7-ig S30 ? Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AH-8 S30 pozitív Z pKT280(Pst)/HclF-2h)Ah-2,6(7 S30 _ ? Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH-l,3,4,5 S30 pozitív Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH-l .2,3,4, 5,8 S30 ? Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH 6,7 S30 pozitív Az extraktum forrása: E. coli HB 101-t transzformálva a következőkkel 2. Kísérlet** Preparátum IFN-a aktivitás (N.E./ ml) Z pKT279/HclF-2h-AH-8 S30 és S100 300 Z-PKT280/HcIF-2h-AH-l ,3,4,5, S30 és SÍ 00 300 Z-pKT28 7/HcIF-2h-AH-6 és 7 S30 és S100 300 Z-pBR322(Psti)/HcIF-SN-4,5, 7,9,10,11,13-16 S30 neg. (<10) Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-l 8-22-ig 24,25,2 7,30—34-ig S30 neg. (<10) Z-pBR322(Pst)/HclF-SN-38-41 -ig 43-48-ig S30 neg. (<10) *1. Kísérlet: Az extraktumokat 1 : 150 végső hígításban vizsgáljuk. **2. Kísérlet: Az extraktumokat 1 : 6 végső hígításban vizsgáljuk. 2. kísérlet folytatása Preparátum INF-q aktivitás (N-E./ ml) Z-pBR3 22(Pst)/HcIF-SN-l -3 -ig S30 10 6,8,12,17,23,26 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-28,29, S30 10 36,37,49 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-35,42 S30 200 Néhány fentiek alapján igen aktív származékot részletesebben vizsgálunk. A kultúrákat a késői log fázis eléréséig tenyésztjük (látszólagos OD650 kb. 0,9)* és a sejteket a fenti módon, a kultúra térfogatának 1/50 részében lizáljuk. Negatív kontrollként Z-pBR322(Pst)fhcIF-SN32-t használva, a következő eredményeket kaptuk: Az extraktum forrása: E. coli HBlOl-t transzformáló Prera-IFN-a minta tátum aktivitás • **(N.E./ ml) (két tős vizsgálat) Z-pKT279(Psti)/Hcl F-2h-AH8 S30, 100, S100 300 Z-pKT280(PstÍ)/HcIF-2h-AH3 S30 1000, SÍ 00 1000 Z-pKT287(Pst)HcIF-2h-AH6 S30 200 S100 200 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35 S30 1000 S100 1000 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42 S30 300 S1000 100 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN32 S30 S100 0,0 Nyilvánvaló, hogy az ezekkel a törzsekkel termelt aktuális fehérje szerkezetét nem analizáljuk annak eldöntése céljából, hogy az IFN-hez nem tartozó aminosavakkal összekapcsolódva vagy az IFN szignál szekvenciáját részben vagy teljesen tartalmazva keletkezik. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 21
