194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 À 7-1 II telepeket tartalmazó szűrőt 4xSET-t (0,15 mól/llter NaCI-t, 20 mmól/liter Trisz HCl-t (pH = 8), 1 mmól/llter EDTA-t tartalmazó oldatot nevezzük SET-nek), 0,1% (s/tí) Ficollt, 0,1% polivínflplrrolldjnt, 0,1% (s/tf) BSÂ-t, 0,5% SDS-t és 200 Mg/ml denaturált, fragmentált lazac sperma DNS-t tartalmazó eleggyel 7 órán át 68°C hőmérsékleten előhibrldlzáljuk, majd 2x10s cpm 32P-vel jelzett Hif-4c fragmenssel, 4 x SET-t, 0,02% (s/tf) Ficollt, 0,02% polivinllplrrolidint, 0,02% (s/tQ BSA-t, 0,5% SDS-t és 200 fJglml denaturált lazac sperma DNS-t tartalmazó elegy ben 68°C hőmérsékleten 16 órán át hibridizáljuk. A szűrőt SET-0,5% SDS oldattal szobahőmérsékleten átöblítjük, 2xSET-t és 0,5% SDS-t tartalmazó oldattal 68°C-on 5 órán át mossuk, mégegyszer új oldatot adunk hozzá, majd szobahőmérsékleten 4 órán át 3 mmól/liter tris-pufferrel majd ismét új oldattal mossuk meg. Szárítása után szkrinelés céljából a szűrőre röntgen filmet helyezünk és 80 órán át hagyjuk rajta. Három telep — X-1II-7D, X-III-2H és \-III-4c - erősen pozitív, két telep — A-III-1E és X-ÍII-3D - gyenge eredményt ad. Hif-4c-nek megfelelő klónokból kicsiny kultúrákat készítünk, a I DNS-t tisztítjuk, Pst I-gyel hasítjuk és a fentiekben ismertett módon agaróz gélen végzett elektroforézissel analizáljuk. Valamennyi I DNS egy nagy fragmenst (pBR322 plazmid részt) és egy kicsinyt (hibrid inszertet) eredményez. A X-III-2H telepből származó rekombináns DNS molekula szabadítja fel a legnagyobb inszertet, mely kb. 900 bp.p.-t tartalmaz. F. rekombináns DNS molekulát Z-pBR322 )Pst)/HcJF-2H (Hif-2H) jelöléssel újuk le, inszertjét pedig Hif-2H fragmensnek nevezzük. Hif-2H IFN-amRNS-hez való kötődési képességét DTP papírhoz (4 pg/100 mm2) való kötődésével és poli(A)RNS-sel (0,3 ptg/ml) való 16 órás hibridizációjával - miként a fentiekben ismertettük — majd az IFN-amRN aktivitás meghatározásával jellemezzük: DNS-minta IFN-aaktivitás (NE/ml)* Hif-2H 250+50 (négy meghatározás átlagértéke) Z-PBR322 (H3) 30 (xét meghatározás átlag/Rc/3G-4.13 értéke) pBR322 20 Hif-2H-t - a Hif-4C-nél ismertetett módon — újraklónozzuk és Hif-2H-vel jelöljük "Citopatikus hatás csökkentése alapján végzett vizsgálat. Egy további kísérletben rekombináns DNS molekulákat tartalmazó E. coli kiónok egy újabb sorozatát készítjük el, és a jelzett Hif-4c fragmenssel hibridizált telepeket azonosítjuk. Hosszú cDNS inszertekeí tartalmazó plazmidok magas hozamának biztosítása céljából leukocita poli(A)RNS-ből enzimatikusan előállított kettősláncú 3iP-vel jelzett leukocita cDNS egy részét (ugyanaz cDNS előállítás, melyet fentiekben Ismertettünk) répacukor sűrűségi gradiensen keresztül történő méret szerinti centrifugálással frakcionáljuk, ugyanazzal a módszerrel, melyet a Poli(A)-RNS centrifugálásnál ismertettünk. A frakciók 600 b.p. tartalomnak megfelelő ülepedés! sebességű cDNS-t tartalmaznak. A DNS fragmentet vagy ennél nagyobbat egyesítjük és a cDNS-t etanollal történő kicsapást követően elkülönítjük. A cDNS-t dCMP 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 részekkel hosszabbítjuk meg és dGMP-vel meghoszszabbított, Pst I-gyel hasított pBR3 22-vel hibridizáljuk, és a hibrid DNS-t a fentiekben Ismertett módon E. coli transzformálására használjuk, azzal a kivétellel, hogy E. coli HBlOl-t használunk. A baktériumot 8 cm átmérőjó Millipore szűrőkön szétolaszlatjuk, majd Tripton közegű agar lemezekre helyezzük (melyek 10 jUg/ml tetracildint is tartalmaznak) és kicsiny telepek megjelenéséig tenyésztjük azokat. Egy szűrő másolatot készítünk olyan mór don, hogy egy friss, nedves Millipore szűrőt helyezünk a telepet hordozó szűrőkre, majd onnan levéve lapjával felfelé 4,4% glicerint tartalmazó agar lemezre helyezzük, és kis telepek megjelenéséig inkubáljuk. Ezt a telepepket hordozó szűrőt egy újabb Millipore szűrővel fedjük le, - 55"A hőmérsékletre hűtjük és tároljuk (D. Hanahan és M. Meselson, „A Protocol For High Density Plasmid Screening , 1978. szeptember). Tizennyolc, összesen kb. 5000 telepet hordozó szűrőt készítünk. Valamennyi lemez egy másolatát 32P-vel jelzett, Pst I-gyel kivágott Hif- 4c DNS fragmenssel hibridizáljuk, a fentiekben ismertetettel teljesen azonos módon. Kb. 185 pozitív telepet azonosítunk az autoradiogramon, Millipore szűrőkön ezeket újraklónozzuk, és újabb hibridizációval azonosítjuk. A 95 legerősebb hibridizációs válaszreakciót adó kiónokat Z-pBR322 (Pst) /HclF-SNl-SN95 szimbólumokkal jelöljük és a további vizsgálatokban használjuk. Nyilvánvaló, hogy a Hif-2h-nak az a képessége, hogy HulFN biológiai vagy immunológiai hatásával rendelkező polipeptidet állítson elő, (1. alábbiakban) lehetővé teszi, hogy a Hif-2h-t és annak megfelelő más DNS szekvenciákat, pl. Hif-4c-t, e klón szkrinelési technikában, továbbá más, rekombináns DNS technológiával, szintézissel, természetes forrásból vagy ezek kombinációjából származó DNS szekvenciákat tartalmazó kiónok esetében, vagy egyszeres vagy többszörös mutációval, bázis szubsztitúcióval, inszertálással, inverzióval, vagy részletek kitörlésével kapott bármelyik fenti DNS szekvenciának megfelelő DNS szekvenciákat tartalmazó kiónok esetén, a HuIFN-t kódoló más DNS szekvenciák és kiónok kiválasztására ugyanúgy használjuk. így, ilyen DNS szekvenciák és azonosításuk szintén a találmány tárgyát képezik (1. alább). Továbbá azok a DNS szekvenciák, melyeket még a fenti DNS szekvenciák során nem szkrineltünk, és melyek nukleotíd szekvenciája polipetidek expresszióját kódoló fenti DNS szekvenciák expresszióját kódolja, szintén a találmány tárgyát képezik. Hif-2h DNS inszert további jellemzése Mint ahogyan már a fentiekben ismertettük, a Hif-2h rekombináns DNS molekula egy kb. 900 b.p.ból álló inszertet tartalmaz, és humán leukocita interferon mRNS-sel hibridizál. Az alábbiakban további jellemzőit ismertetjük. 1. Hibriddel leállított lefordítás Abban az esetben, ha a mRNS egy klónozott, komplementer cDNS-sel hibridizál, úgy a mRNS lefordítása gátolt, azonban a hibrid hő-denaturálásával lefordítható mRNS szabadul fel [B. M. Paterson et al., „Structural Gene Identification And Mapping By DNA-mRNA Hybrid-Arrested CeD-Free Translation”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 4370-74. o. (1977)]. 2,2 MS Pst-I-gyel hasított Hif-2h-t és kontrollként 2 Mg Hind-III-mal hasított Z-pBR322 17
