194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 013) /Rc/3G-4,13-t (RcßG) 10 ß 80%-os (tf/tf) ionmentesített formamidot és 20 mmólos PIPES puffert (pH = 6,4) tartalmazó oldatban 10 percen át 80°C hőmérsékleten denaturálunk. Az oldatot 5 pg poli-(A)RNS-t, 4 pmól NaCl-t és 10 nmól EDTA-t száraz formában tartalmazó Eppendorf csőbe visszük. Az elegyct paraffin olaj réteg alatt 7 órán át 48°C hőmérsékleten melegítjük, majd lehűtjük és 200 ß H2 O-val hígítjuk. A két mintát egyenlő részekre osztjuk, melyek mindegyikét lOOrC hőmérsékleten 30 másodpercen át hevítjük. A nukleinsavakat etanollal csapjuk ki, majd 3 ß Ha O-ban feloldjuk, majd a fenti módon oocitákban az IFN-amRNS aktivitást meghatározzuk. DNS Bevitt kezelés IFN-a poli9(A) (N. E/ml)* -RNS mennyisége Hif-2h (1,1 pg) 2,5 hibridizált 400 Hif-2h (1,1 pg) 2,5 hibridizált és denaturált 2000 Rc0G(l jug) 2,5' hibridizált 3000 Rcj3G(l/Jg) 2,5 hibridizált és denaturált 3000 Hif-2h (0,5 pg) 1 — 2000 — 1 — 3000 — 1 — 2000 Ennek alapján Hif-2h, amikor poli(A)RNS-sel hlbridizál, az IFN-amRNS poli(A)RNS-ben való lefordítását gátolja, a hibrid denaturálása után azonban az IFN-amRNS ismét lefordítható. E kísérlet megerősíti, hogy a Hif-2h az IFN-amRNS-sel komplementer szekvenciát tartalmaz. 2. Restrikciós enzimmel történő hasítással végzett analízis, nukleotid/aminosav szekvencia meghatározása és a restrikciós térkép szerkesztései Hif-2h-t különböző restrikciós enzimekkel (New England Biolab) emésztjük, és a kapott termékeagaróz gélen végzett elektroforézissel analizáljuk. Aláhúzással jelöljük a pBR322 és a Hif-2h nem közös fragmenseit. Restrikciós enzim Fragmens méret Hif-2h*‘ pBR322*** PstI 885 ± 20,4361 4361 EcoRI 1426,3820 4361 BglII 5246 nem EcoRI ♦ Bgl n 336,4960 4361 EcoRI + Pst I 209,676,748 3611 748,3611 Pspl 921,587,540, 587,540,504, 504 457 457,434,2x231 434,267, ♦ 14 fragmens ♦ 14 fragmens 200 bp. 200 bp. MboII 1616,884 stb. — *Az oocita közeget dtopatikus hatás inhibiciós módszenei 48 óra múlva vizsgáljuk. *• Bár belsőleg e fragmensck abszolút mérete megegyezik, a 8-10. ábrán szemléletesebb képet adunk. “‘Sutcliffe eredetű (lásd fent) Továbbá, az 5’ terminálison **P-vel jelzett Pstlgyel hasított Hif-2H-t néhány restrikciós enzimmel elhasítjuk és a rekombináns DNS molekulában lévő cDNS inszertből származó radioaktív fragmensek méretét meghatározzuk. Restrikciós enzim *1 P-fragmens* EcoRI 676,209 HindlII nincs hasítás Bspí 799,86 Hpall nincs hasítás Hhal nincs hasítás BamHI nincs hasítás fünf 210,62 BglII ( 545,340 A fenti adatok alapján a Hif-2h restrikciós térképét megszerkesztjük (4. ábra). A térkép a helyek abszolút helyzetét illetően nem definitiv, és MboH inszerten belüli helyeit illetően lehetséges, hogy nem teljes. Csak az inszcrthez legközelebbi helyek vannak megadva a pBR322 részen belül. Nyíllal szemléltetjük az IFN-acDNS-t kódoló szál elhelyezkedését. Jóllehet a Hif2h fragmens vagy a találmány szerinti kiónokban lévő más inszertek aktuális szerkezete vagy az ezek által kódolt polipeptidek aminosav szekvenciája vagy szerkezete e találmányt készítő és használó szakember számára nem szükséges, a fenti adatokat és restrikciós térképet — mint az eredeti szabadalom benyújtása időpontjában a fragmens szerkezetéről legtöbb hozzáférhető információt nyújtó adatokat — az eredeti szabadalmi leíráshoz csatoljuk. Azóta, amint az várható volt (1. előbbiekben — 11. o.) Hif-2h fragmens restrikciós térképét és ezeket az adatokat a jól ismert nukleotid szekvenciás technikák és restrikciós analízis alkalmazásával tovább finomították. [például A. M. Maxam é^ W. Gilbert, ,,A New Method For Sequencing DNA , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560—64. o. (1977)] A plazmid DNS-t a ß-mödszerrel állítjuk elő [N. M. Wilkie, et al., „Hybrid Plasmids Containing An Active Thymidine Kinase Gene Of Herpes Simplex Virus 1 , Nucleic Acids Research, 7, 859-77. o. (1979)], és különböző restrikdós enzimekkel, előnyösen a kiegészítés által ajánlottakkal — kivéve, hogy a 200 pg/ml zselatin helyett az enz. n pufferben szarvasmarha szérum albumint használunk - kezeljük, (az enzimeket a New England Biolabs-tól szereztünk be) , 20 pg restrikdós enzimekkel kezelt DNS-t fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 0,05 mólos Tiisz-HCl-ben (pH = 8) feloldjuk, Chelex-100 típusú kjs oszlopon vezetjük át. Az egyforma hosszú vagy 5 -túlérő végeket tartalmazó fragmenseket 200 ß 0,05 mólos Trisz-HCl-ben (pH = 8) 60 percen át 3/C hőmérsékleten a DNS 5’ végeinek pmóljaira számítottan 0,2 egység borjúból alkalikus foszfatázzal (Boehringer) végzett kezeléssel defoszforilezzük. Az enzimet 60 percen át 65°C hőmérsékleten végzett hevítéssel inaktiváljuk. A 3’-túlérő végekkel rendelkező DNS fragmensek esetén bakteriális alkalikus foszfatázt (Worthington) használunk, miként azt A. M. Maxam és W. Gilbert fenti közleményükben ismertetik, kivéve, hogy az inkubádót 65°C hőmérsékleten 30 percen át végezzük. A defoszforflezett DNS-t DEAE-cellulóz oszlopon történő abszorpdóval majd eludóval [W. Muller et al., „Site-Directed Mutagenesis In DNA: Generation Of Point Mutations In Cloned B-Globin Complementary DNA AT The Postitions Corresponding To Amino Adds 121 — 123 J. Mol. Biol., 124, 343-58. o. (1978)], vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 18
