194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 Ezután 30 ß fenol-kloroform 1 : 1 arányú elegyével extraháljuk, a szerves fázist 50 ß 20 minól/Uter Trisz-HCl-t (pH = 7,5) és 1 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldatta] mossuk, és az egyesített vizes fázist éterrel háromszor extraháljuk, majd 0,1 ml-es Chelex ioncserélő oszlopon (gyártja: Bio-Rad Laboratories^ USA) szűrjük át. A szürletet EDTA-val forralt Pyrex® csőbe gyűjtjük és 1/10 térfogatrész nátrium-acetáttal, valamint 245 térfogatrész etanollal kicsapjuk. Éjjelen át ~206C-on állni hagyjuk, majd a DNS-t centriv fugálással elkülönítjük. B. lépés: DNS poli(A)RNS-sel történő hibridizációja Két hibridizációs elegyet készítünk: /. elegy: 4 ß tízszeres koncentrációjú hibridizációs puffert, amely 4 mól/liter NaG-ot, 0,1 mól/liter PIPES-t (1,4-piperazin-dietán-szulfonsav-Sigma), 50 mmól/liter EDTA-t, 0,5 ß (kb. 0,5 ng) ^^l-globin mRNS-t (5000 cpm) és 6 ß indukált leukocita poli(A)RNS-t (2 ßlß koncentrációjú) tartalmaz, készítünk, amely elegendő mennyiség althoz, hogy oocitákba történő injektálásakor 6000 NE-nyi IFN-t generáljon. II. elegy: 10 pg fenti, Hind HT-mal emésztett I DNS-t és 0,1 pg Pst I-gyel emésztett Z-pBR322(H3)Rcj3G- 4.13-t (olyan pBR322 származékot, amely a Hind ül helyen j3-globin szekvenciát tartalmaz) [Mantei et a., „Rabbit /J-globin mRNA Production In Mouse L Cells Transformed With Cloned Rabbit ß-globin Chromosomal DNA , Nature, 281, 40—46. oldal (1979)= tartalmaz. . ■ Az I. elegyben a J ^I-globin mRNS és a II. elegyben a ß-globin DNS a hibridizációs vizsgálatban belső pozitív kontrollok szerepét töltik be. Mindkét elegyet nitrogén gázáramban szárítjuk. A II. elegy szárítás utáni maradékához 40 pú 80%-os formamidot adunk és az oldatot 100°C hőmérsékleten 10 percen át denaturáljuk, majd jéggel gyorsan lehűtjük. E denaturált oldatban feloldjuk az I. elegy szárítás utáni maradékát és a kapott oldatot 4 órán át 56°C hőmérsékleten inkubáljuk. C) lépés: A hibridizált poli(A)RNS-DNS nem-hibridizált poli(A)RNS-től való elkülönítése Hideg, 0,9 mól/liter NaCl-t és 0,09 mól/liter Na-citrátot tartalmazó oldattal 1 ml-re, valamint 100%-os formamiddal 4%-ra (térfogatra vonatkoztatottan) történő hígítást követően az oldatot Millipore típusú szűrőn (0,45 pm pórusméretű) 0,5 ml/ perc szűrési sebességgel szűrjük, a szűrőt előzőleg az RNS-DNS hibridek visszatartási képességének kapacitása szempontjából megvizsgáltuk, mivel a gyártótól nyert szűrők nem mindegyike egyformán hatásos. D) lépés: A hibridizált poh'(A)RNS tisztítása A fenti poli(A)RNS-hibrideket tartalmazó szűrőt 1 ml 0,15 mól/liter NaG-t, 0,015 mól/liter Na-citrátot tartalmazó, 0,5% SDS pufferbe merítjük 10 percen át 37°C hőmérsékleten, majd 50 mmól/liter Trísz-HG-t (pH = 7,5), 10 mmól/liter MgG2-t és 2 mmól/liter CaG2-t tartalmazó oldattal átöblítjük, majd 0,6 ml friss pufferbe (0,15 mól/liter NaG-t és 0,015 mól/liter Na-citrátot tartalmazó 0,5%-os SDS) helyezzük. 5 pú jódacetáttal kezelt DNS-áz (5 mg/ml koncentrációjú) [S. B. Zimmermann és G. Sandeen, Anal. Blochern. 14, 269. o. (1966), P. A. Price et al., „Alkylation Of A Histidine Residue At The Active Site, Of Bovine Pancreatic Deoxiribonuclease ’, 2 J. Biol. Chem., 244, 924-32. o. (1969)] hozzáadását követően a szűrőt 10 percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a szűrőt eltávolítjuk, az oldatot 1 térfogatrész fenollal és 1 térfogatrész éténél extraháljuk és 0,1 ml-es Chelex oszlopon vezetjük keresztül. Az oldathoz 5 pig szállító (carrier) RNS-t (tisztított élesztő RNS) adunk és nátrium-acetáttal, valamint etanollal az RNS-t kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással (10 000 xg) elkülönítjük és 100 pd 1 mmólos EDTA- ban feloldjuk. Ezután 90 másodpercig 100°C hőmérsékleten tartjuk, és TNE-t és SDS-t adunk hozzá a kétszeres TNE, illetve 0,5%-os SDS koncentráció eléréséig. Ezután az RNS-t 100 pú-es oligo(dT)cellulóz oszlopon adszorbeáljuk, majd 4x0,3 ml desztillált vízzel eluáljuk, és nátrium-acetáttal és etanollal kicsapjuk. A — 20°C hőmérsékleten 16 órás állást követően kivált RNS-t centrifugálással elkülönítjük és 2 pd TNK pufferben feloldjuk. E) lépés: Az IFN-amRNS aktivitásának meghatározása A fentiekben kapott RNS oldatot 40 oocitába injektáljuk (kb. 50 nl-t egy oocitába). Az oocitákat 23°C hőmérsékleten 24-28 órát inkubáljuk, homogenizáljuk és centrifugáljuk (vagy az inkubációs közeget távolítjuk el), ezután pedig, az előzőekben ismertetett módon az IFN-a aktivitást meghatározzuk. 4. Következő vizsgálat: A szűrőhöz kötött DNS-sel történő hibridizáció Az egy kiónból származó rekombináns DNS molekula következő vizsgálatait általában DBM vagy DPT papírhoz kötött DNS-sel végzik, részben a vizsgálat körülményei már nem kritikusak, továbbá célszerűségi okokból. Előnyösen DPT papírt használunk. A DBM papírt ismert módon készítjük [J. C. Alwine et al., „Method For Detection of Specific RNAs in Agarose Gels By Transfer To Diazobenzyl Oxymejhyl. Paper And Hybridization With DNA Probes , Pore. Natl. Acad. Sei. USA, 14., 5350- 54. o. (1977)]. Az APT papírt az alábbiak szerint készítjük. Whatman 540 típusú papíríveket (20 g-ot) 16 órán át 20°C hőmérsékleten 70 ml 0,5 mól/ liter NaOH-t, 2 mg/ml NaBH^-t tartalmazó oldat és 30 ml 1,4-butándiol-digMdil-éter elegy ével kezeljük. Ezután a papírt 10 ml 2-amino-tiofenol 40 ml acetonnal készített oldatával 10 órán át kezeljük, majd acetonnal, 0,1 n HG-lel, H2O-val, 0,1 n HG-lel és ismét H2 O-val alaposan átmossuk és szárítjuk. Az APT papírt diazotáíással alakítjuk át DBT típusúvá, az ABM papír DBM típusúvá történő átalakításánál alkalmazott módszert követve (lásd Alwine és munkatársainak fentebb idézett munkáját). A DNS-t (15 pg mennyiség elérésig) 50 mm2-es diazotált ABM (DBM) vagy diazotált APT (DPT) papírhoz J. H. J. Hoeijmarkers és munkatársai módszerével („The Isolation Of Plasmids Containing DNA Complementary To Messenger RNA For Variant Surface Glycoproteins Of Trypanosoma Brucei’, Gene, nyomdában, 1980) az alábbi módon kötjük meg. Hibrid plazmid DNS-t PstI endonukleázzal emésztünk, mflliliterenként 500 pg pronázzal, 0,5%-SDS-sel és 10 mmólos EDTA-val 30 percen át 37°C hőmérsékleten kezeljük majd fenollá] és éterrel extraháljuk, 0,1 ml-es Chelex oszlopon vezetjük keresztül 194 305 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
