194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására

1

194 305

2

és etanoOal kicsapjuk. A hővel denaturált DNS-t (5 pç mennyiségig, jelzett vegyületként kevés mennyiségű SÍP-DNS-sel együtt) 0“C hőmérsékleten 1 cm1 DBM vagy DPT papírral 200 pd 25 mmólos kálium-foszfát pufferben (pH = 6,5) éjjelen át inkubáljuk. A szűrőket 5 percen át szobahőmérsékleten háromszor 50 mmólos kálium-foszfát pufferrel (pH = 6,5) amely 1% gllclnt Is tartalmaz, majd háromszor 99%-os átkristályosított formamlddal mossuk. Ezután 99%-os formamlddal 2 percen át 68°C-on ismét inkubáljuk, majd háromszor 50 mmólos kálium-foszfát pufferben (pH = 6,5) 20°C hőmérsékleten és kétszer 0,4 mólos NaOH-ban 37°C hőmérsékleten 10 percen át mossuk. A radioaktivitás kb. 40—60%-a marad a szűrőkön. A szűrőket A típusú pre-hibridizációs közegben, melyet 1%-os glicinnel egészítünk ki, 3 órán át 38°C hőmérsékleten inkubáljuk, 330 pä-t használva szűrőként. Az A közeg 50% formamidot, 5xSSC-t, 0,04%-os polivinil-pirrolidont, 0,04% Ficollt (Pharmacia), 0.1% SDS-t, 25 pig poli(A)-t (P et L) és 100 pig fenollal hatszor extrahált és etanollal kicsapott élesztő RNS-t (forgalmazza: British Drug Houre, Nagy-Britannia) tartalmaz.

A szűrőket az A közegben kétszer mossuk meg, majd 16 órán át 38°C hőmérsékleten - a vázolt módon ) poli(A)RNS-sel (rendszerint 5-8 ptg-ot használunk) paraffin olaj alatt az A közegben hibridizáljuk. Az RNS-t a következő módon adjuk a rendszerhez: a nedves DNS-szűrőt leitatjuk és steril petricsészébe helyezzük, majd 20- 40 pd RNS oldatot plpettázunk a szűrőbe, és e tetejére egy második DNS szűrőt (vagy egy másodpéldányt vagy egy kontrollt) helyezünk, majd steril paraffin olajjal fedjük le. A hibridizációt követően a szűrőket egymás után a következő oldatokkal mossuk meg:

kétszer az A közeggel, 1 x SSC-t, 0,2% SDS-t, 1 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldattal háromszor (mindegyik mosást 20°C hőmérsékleten 10 percen át végezve), A tápközeggel (2 órán át 28°C-on) és háromszor 50%-os formamidot, 5 x SSC-t, és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal (a mosást 20rfC hőmérsékleten 10 percen át végezve). A hibridizált RNS-t 200 pl 10 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH = 7,4), 1 mmól/ litero EDTA-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldatban 100°C hőmérsékleten 1 percen át történő hevítéssel eluáljuk. Az eluciót még kétszer megismételjük, s az eluátumokat egyesítjük. 2 pig élesztő-RNS hozzáadása után - melyet a fend módon tisztítunk - az RNS-t etanollal csapjuk ki. A csapadékot mosás után vákuumban szárítjuk, 3 pl vízben feloldjuk és oocitákba injektáljuk. Az IFN-a aktivitást a fenti módon határozzuk meg.

5. Az RNS szelekciós hibridizációs vizsgálat eredményei

Az 512 klón 8 csoportjával (azaz a T, Y, j, K, O, É és rr jelű csoportokkal kapott eredmények negatívak. Az 512 klón 4 csoportjával (azaz az I, ő, N és X csoportokkal) kapott eredmények pozitívak, bár nem következetesen. A pozitív kísérletet az alábbi formában oldjuk meg:

poü(A)RNS-DNS hibridből felszabaduló RNS által termelt 1FN-<I, NE/ml-hez (kontroll hibridizációként Z-pBR322(H3)/Rc0 G4,13-t használunk - miként fentiekben ismertettük); azokat a kísérleteket, amelyekben az eredmények a viszonyítási kontrolihoz képest magasabb értékűek, aláhúzással jelöljük:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Csoport: NE/ml

I < 60 (<60), 110 (<20), < 110,

(< 110). < 35 (<35)

6 20 (<20)

N 35 (<20), <110 (<110), 200 (<110)

X <60 (<60), 60 (<20), Hl 10 (<110),

<110 (<110)

A X csoportban a 64 kiónt 8 alcsoportba osztjuk, és a fenti módon hibridáljuk, majd értékeljük az eredményeket.

Alcsoportok NE/ml

X-I <35 (<35), <35 (<35)

X-n 130 (<30), <45 (<45)

X-m 225 (<35), ^5 (<30), 35 «30),

600 (<30) 20 (<20)

X-IV 85 (<35), H25 (<25)

X-V 35 (<35)

X-VI 35 (<35)

X -Vn 35 (<35)

X-VIII 35 (<35)

A X—III alcsoporthoz tartozó 8 kiónt 8 sorozatra osztjuk és a fenti módon hibridizáljuk, majd értékeljük az eredményeket:

Sorozat NE/ml

X-ffl-1 <20 (<20), H20 (60), 35 (<30) X-III-2 <35 (<35), <30 (<30), 150 (<20), 600 (<35), 110 (60)

X-III-3 <25 (<25), <30 (<30)

X-III-4 30 (<30), <20 (<20), <20 (60)

X-m-5 30 (<35), <20 (<20), <35 (60)

X-III-6 <30 (<30), <20 (<20)

X-m-7 <30 (<20)

X-III-8 <30 (<20)

Minthogy a X—IIÍ-4 sorozattal kaptuk az első pozitív eredményt, az ehhez a sorozathoz tartozó egyedi telepeket (A-tól H-ig jelölve ezeket) hibridizáljuk és értékeljük az eredményeket):

X-ni-4-B <35* (<35), <20 (60)

X -III-4C 35 (60), 60* (<35), 111* (<11), 11* «11), 20 (H20)

Tehát a X IIII 4- C-klón IFN-qmRNS-t hibdirizálni képes rekombináns DNS-t tartalmaz.

Az ebben a kiónban lévő rekombináns DNS molekulát a Z-pBR322 (Pst)/HcIF4C („Hif4C”), ill. az azt tartalmazó baktérium törzset E. coli XI776 (Z-pBR322 (Pst)/HcIF4C) („E. coli Hif4C )) szimbólumokkal írjuk le. E nomenklatúra arra utal, hogy a rekombináns DNS molekula zürichi eredetű (Z) és a pBR322 plazmid a Psti I helyen HlFN-a-cDNS-t (HclF) tartalmaz, Ül. a szóbanforgó rekombináns DNS molekula a X-III4C klónból (4C) származik.

Z-pBR322(Pst)/HcIF-4C jellemzése és újraklónozdsa

Mivel a transzformált sejtek elsődleges kiónjai esetenként több mint egyfajta rekombináns DNS molekulát tartalmaznak [Efstratiadis et al., „The Primary Structure Of Rabbit ,,-globin mRNA As Determined From Cloned DNA”, Cell. 10, -571 —81. o. (1977)], Hif4C-t E. coli XI776 (Hif4C) Hónokból különítjük el, és a fenti módon tisztítjuk. A Hlf4C és pBR322 mintákat Pstl-gyel emésztjük, és 1%-os agaróz gélen elektroforézissel analizáljuk. Hlf4C két sávot eredményez, az egyik Pst-tel hasított pBR322-nek megfelelő mozgékonyságú, mig a másik kb. 320 b.p.-nak megfelelő mozgékonyságú.

*A DBM papír módszert használjuk e kísérletekben

15