194284. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és in-vitro reagens-készlet glikokólsav meghatározására
1 zin, tiramin, fenilglicin, triptofán, 5-hidroxi-triptofán, hisz (amin és hisztidin. 1. Táblázat Keresztieakciók (%) Epesavak (triviális név) Találmány szerinti in> munizálás adatai Irodalmi adatok ABC Glikokólsav 100 85 100 100 Taurokólsav 0,5 100 130 16,5 Kölsav <0,1 3,1 50 7,8 Glikokenodezoxikólsav 3,1 62 4,2 14,5 Taurokenodezoxikólsav < 0,1 210 1,3 3(2 Kenode/.oxikólsav <0,1 8,1 1,5 3,3 Glikodezoxi kólsav 0,8 3,3 1,2 2,8 Taurodezoxikólsav <0,1 4,0 3,7 1,7 Dezoxikolsav <0,1 0,2 0,9 1,0 Glikolitokólsav <0,1 3,3 1,4 0,4 Tau roli tokét* sav <0,1 nem 1 0,3 0,3 LitokóLsav < 0,1 vizsg. 0,7 0,1 0,1 A: Gastroenterology 72, 305 (1977) B: International Atomic Energy Agency (IAEA)-SM 200/87(1977) C: Clin. Chem. 27/10, 1698 (1981)és a 4,264,514 sz. amerikai szabadalmi leírás A találmány szerinti reagens-készlethez tracerként előnyösen 3a-(3-karboxi-propionil) -glikokólsav-metilészter-115I-hisztamin konjugátumot alkalmaztunk. A hisztamin és az (I) képletű haptén, a 3a-(3-karboxipropionil) -glíkokólsav-metil-észter kapcsolását ismert módon, vegyesanhidrides módszerrel (Brit. J. Sports. Med. 9, 89 (1975) végeztük, de karbodiimides módszerrel (IAEA-SM 220/87 (1977) is elvégezhetjük. A radioaktív jódjelzés, például 12’I-dal, történhet a kapcsolást megelőzően vagy a kapcsolás után. A 11 s I- dal történő jlezést a Chloranrin-T technikával (J. Endocrinol. 57. XVII (1973) a kapcsolás előtt és után is elvégeztük. Az így előállított tracer tisztítására oszlopkromatográfiát és vékonyrétegkromatográfiát alkalmaztunk. A fentiek alapján a találmány további tárgya eljárás üj tracer előállítására, amely abban áll, hogy az (I) képletű haptén szabad karboxil-csoportja és valamely radioaktív jelzésre alkalmas aminosav vagy amin aminocsoportja között a peptidkémiában szokásos módon peptidkotést hozunk létre és az aminosavat vagy az. amint a kapcsolás előtt vagy után ,JSI-dal ismert módon jelezzük. A találmány szerinti eljárással előállított nagy specifikusságú antiszérum és tracer a glikokólsav pontos meghatározását teszi lehetővé. Ezért a találmány to4 2 vábbi tárgya glikokólsav meghatározására alkalmas in vitro reagens-készlet, amely az alábbi a) — f) komponenseket tartalmazza: a) A találmány szerinti eljárással előállított tracert pH=7,4-t biztosító alkalmas puffer-oidatban. A traceroldat aktivitása előnyösen max. 0,25 pCi/ml (9,25 kBq/ml). b) A találmány szerinti eljárással termelt antiszéruivot liofilizált állapotban, amely 5—50 ezeiszeres véghígításban alkalmazható. ej A meghatározandó glikokólsav standardokat liofilizáh állapotban. d) A meghatározandó gükokólsavat ismert koncentrációban tartalmazó kontroli szérum-mintákat li-0 fii ízált állapotban. e) A b) összetevő és a vizsgálandó mintákhígításá-1 oz szükséges pH = 7,4-t biztosító alkalmas puffer-olcatot. f) A szabad és kötött frakció szétválasztására szolgáló reagens oldatot. A glikokólsav meghatározásához szükséges in vitro reagens-készlet a) — f) komponensei 100 csőből álló készlet esetén a következőek lehetnek: aj Tracer: 3<*-(3-karboxj propionü) -glikokólsavinetil-észter-13 s I-hisztamin konjugpt reagens oldat 20 ni, 0,9%-os nátrium-kloridos foszfátpuffer (PBS), pH = 7,4) oldatban. A tracer-oldat aktivitása 0,25/uCi/ml (9,25 kBq/ml) vagy ennél kisebb. A tiacer-oldat 0(2% bovin gammaglobulint, 0,3% BSA t és 0,1% nátriumazidot is tartalmaz. Bemérendő mennyiség: 0,2 ml csövenként b) Glikokólsav antiszérum: a találmány szerinti eljárással termelt nyúl antiszérum liofilizált állapotban. Ujraoldásához 20 ml nátrium kloridos foszfát puffert (pH = 7,4) használunk,a mely 0,2% bovin gammaglobuline 0,3% BSA-t és 0,1% nátriunvazidot is tartalmaz. Bemérendő mennyiség: 0,1 0,2 ml csövenként. c) Glikokólsav standarok: 0—0,50 1,5- 5,0 -15,0 - 50,0 /Jmól/1 glikokólsav koncentárciójú oldatok liofilizált állapotban. Ujraoldáshoz 6x0,5 ml pufferoldatot használunk Bemérendő mennyiség a standar görbe felvételéhez: 0,1 ml csövenként. d) Ismert alacsony (0,50-1,5 pmól/1) és magas koncentrációjú 15,0- 50,0 pmól/1) glikokólsav kontroll szérum liofilizált állapotban. Ujraoldáshoz 2x0,5 ml desztillált vizet használunk. e) Foszfát puffer oldat (pH = 7,4), amely 0,2% bovin gammaglobulint, 0,3% BSA-t és 0,1% nátrium-azidot tartalmaz, térfogata 50 ml, s melyet az antiszérum (b) és a vizsgálandó szérum minták hígítására használunk f) Polietilén-glíkol 6000 reagens: 60 ml 30%-os vizes oldat, amely 0,9% nátrium-kloridot és 0,1% nátrium-az.idot is tartalmaz., s amely a szabad és kötött frakció szétválasztására szolgál. Bemérendő mennyiség: 0,5 ml csövenként. A fenti reagens-készlettel biológiai folyadékmin ták (véiszérum, epe, vizelet, szélet extraktum stb.) előnyösen vérszérum glikokólsav tartalma határozható meg. A glikokólsav meghatározását radioimmunmódszerrel ismert módon az alábbiak szerint végezzük: az előzőekben felsorolt, felhasználásig 4°C-on tartott komponenseket hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni és a liofilizátumokat desztillált vízben, illetve pufferben feloldjuk. Az első két RIA csőbe (TA- teljes aktivitás jelöléssel) 0,2 ml tracer oldatot mérünk. A 3. és 4. csőbe (NSK * nem specifikus kötés 194.284 5 to 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
