194284. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és in-vitro reagens-készlet glikokólsav meghatározására
1 jelöléssel) 0,2 ml tracer oldatot és 0,3 ml gammaglobolinos PBS oldatot mérünk. Az 5. csőtől a 16. csőig 0,1 ml - 0,1 ml glikokólsav standard oldatokat mérünk (2—2 párhuzamos oldat bemérésével) a 0; 0,5; 1,5; 5,0; 15,0 és 50,0 pmól/1 koncentárciójú üvegekből. A csövekhez ezt követően 0,2 ml tracer oldatot és 0,2 ml antiszérumot adunk, majd jól összerázzuk örvénykeverővei. A 17. csőtől kezdődően a vizsgálandó szérummintákból 0,1 ml-t (előzőleg l:10-re hígítva gammaglobulines foszfát-puffer oldattal) mérünk be, párhuzamos mintákat alkalmazva. Hasonlóan a megfelelően feloldott kontroll szárumokból (alacsony és magas koncentrációjú) szintén 0,1 ml-t mérünk be. Ezt követően 0,2 ml tracert és 0,2 ml antiszérumot adunk minden csőhöz és jól összerázzuk őket. A csöveket szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, majd minden csőhöz (1—2 kivételével) 0,5 ml polietilén-gjikol oldatot adagolunk, jó! összerázzuk a mintákat örvény ke verő vei, majd 15 percig szobahőmérsékleten 1500 g alkalmazásával centrifugáljuk. A felülűszókat vízlégpziYattyúva] eltávolítjuk. A csövekben maradt radioaktivitást gamma sugárzó izotópok mérésére alkalmas készülékkel legalább 1 percig mérjük. A standard oldatok csöveinek beütését elosztva a 0 standard beütéseivel és szorozva 100-zal megkapjuk a kötési (K) %-okat a standardokra, ezt ábrzáolva a koncentráció függvényében féilogarimikus diagramon megkapjuk a standard görbét. Az ismeretlen szérumminták csöveinek beütését elosztva a 0 standard beütésével megkapjuk a K %okát a vizsgálandó mintákra. Ezeket az értékeket a standard görbére vetítve, az ismeretlen szérumminta epesav koncentárciója leolvasható. A K %-os értékek kiszámításánál tekintetbe vesszük a nem specifikus kötés értékeket. A találmány szerinti módszer előnye az ismert módszerekkel szemben a következő: a vérszérum glikokólsav tartalmának mérésére az eddigi legspecifikusabb, igen nagy érzékenységű módszer, amely lehetővé teszi a hepatobiliáris rendszer és az intesztinális traktus megbetegedéseinek pontosabb diagnosztizálását. A találmány szerinti eljárásokat — az oltalmi kör korlátozása nélkül — az alábbi példákon szemléltetjük. 1. példa Immunogén (II) előállítása 17,4 mg (0,03 mmól) 3a-(3-karboxi-propionil)-glikokólsav-metü-észtert 0,2 ml dioxánban oldottunk enyhe melegítéssel. Az oldatot 8°C-ra hűtöttük, majd radioaktív (* H)-glikokólsavat (0,04 pCi) adtunk hozzá. Ezt követően 7,1 pl (0,03 mmól) tri-n-butil-amínnal és 3,8 pl (0,03 mmól) klórszénsav-izobutü-észtérrel elegyítettük. A reakcióelegyet 30 percig 8°C-on kevertettük, 21 híg (0,30 pmól) marha szérum albumint (BSA) 0,8 mid esztillált vízben oldottunk, 0,05 ml 0,5 mól/1 nátrium-hidroxid oldatot adtunk hozzá, majd 0,8 ml dioxánnal elegyítettük. Az oldatot 4°C- ra hűtöttük, majd a fentiekben elkészített vegyesanhidridet állandó keverés közben cseppenként adagoltuk a BSA-oldathoz. A reakcióelegyet 4°C-on három órán át kevertettük állandó pH ellenőrzés mellett, ügyelve, hogy a pH érték 8,3 és 8,5 között legyen. A pH fenntartását 0,5 mól/1 nátrium-hidroxid oldattal biztosítottuk. A reakció idő letelte után a min-2 ta térfogatának 1%-ból meghatároztuk a radioaktivitást, a minta további részét 3 napon keresztül dializáltuk 0,01 mól/1 nátrium foszfát pufferrel szemben (pH = 7,4). A dialízissel megtisztított frakció térfogatának 5%-ából aktívitásmérést végeztünk. A két aktívításmérés alapján a BSA-konjugátumban a fehérje /szteroid mólarány 1:16. A megtisztított frakció anquotjait (100 pg fehérjének megfelelő oldatmennyiség) -20°C-on felhasználásig lefagyasztottuk. 2. példa Tracer előállítása: 3ct-(3-karboxi-propionil) -glikokólsav-metil-észter-1 ?51-hisztamin konjugát. a) Vegyesanhidrid-készítés: 3,7 mg (6,4 pmól) 3a-(3-karboxi-propionil)-glikokó'sav-metü-észtert 0,1 ml dioxánban oldottunk és 10 pl tri-n-butil-amin 1:5 arányú dioxános oldatát és 10 pl kiórszénsav-izobutil-észter 1:10 arányú dioxánoí oldatát adtuk hozzá. A reakcióelegy et 20 percig 8°€-on kevertettük, majd dioxánnal 3,5 ml-re felhígítottuk. b) Hisztamin jelzése 13 s I- dal : Jelzőedénybe bemértünk 37—74 MBq NallsI-ot (MTA Izotóp Intéze.t: I—RB-4 1—125 oldat 0,1%-os Ní-HCOj-ban, 7—11 GBq/cm3), hozzáadtunk 222 ng héztamint, 10 pl 0,5 mól/1 foszfát puffert (pH = 8,0) 50 pg klóramin-T 10 p)-es vizes oldatát. A reakcióelegyet 30 másodpercig kevertettük, majd 300 pg nátrium-metabiszulfit 10 pl-es vizes oldatával elegyítettük. c) Kapcsolás és tisztítás: Az a) szerint elkészített vegyesanhidrid-oldatból 50 pl-t hozzáadtunk a b) szerint elkészített jódozott hisztamin oldathoz 0°C-on. Ezt követően lOpl O,.! n nátrium-hidroxidot adtunk a reakcióelegyhez és 1 órán át állni hagytuk, további 10 pl 0,1 n nátrium-hidrexid hozzáadása után ismét állni hagytuk 1 órán át az oldatot, majd 1 ml 0,01 mól/1 foszfátpuffer (pH = 7,4) alkalmazásával a reakcióelegyet tisztítás céljából Amberlite XAD—2 oszlopra (lg) vittük fel. Az oszlopot a fenti pufferrel, majd desztillált vízzel mostuk, amíg a szabad 12 5I-ot teljesen el nem távolitottuk. Ezt követően az oszlopot absz. alkohollal mostuk és az eluátum 0,2 ml-es frakcióiból aktivitásméréseket végeztünk. Az aktív frakciókat (kb. 2 ml) egyesítettük és negyedrészére bepároltuk. További tisztítás céljíból a bepárolt frakciót DC-Alufolien Kieselgel 60 (Merck) vékonyrétegre vittük fel. A futtató elegy összetétele a következő volt: etil-acetát-metanol-benzol-trietil-amin = 50:25:25:10. A detektálást autoradiográfiával végeztük. A radiokromatogrammon az Rf 0,5 értéknél jelentkező foltnak megfelelő területet a rétegről metanollal eluáltuk. Ennek a metanolos oldatnak (18°C-on eltartható) aliquotjait (20 000 cpm/0,1 ml) PBS oldatban használtuk a továbbiakban tracerként. 3. példa Tracer előállítása: 3a-(3-karboxi-píopionil)-glikokólsav-metil-észter-12 * I-hisztamin konjugát í) 3o-(3-karboxi uropionil) -glikokólsav-metil-észterhisztamin komu^t előállítása: 7,0 ng (35 pmól) hisztamin-sósavas-sót 50 p) desztillált vízben, 12,0 mg (60 pmlól) 1-etil-3- (3-dietü-194.284 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
