194284. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és in-vitro reagens-készlet glikokólsav meghatározására
1 194.2*4 2 fehérjékhez kapcsolják őket. A kutatók a primer epesavakra vonatkozó immunogén előállításánál az epesavak glidn oldalláncának szabad karboxil-csoportját használták fel a fehérjével, például bovin (marha) szérum albuminnal (a továbbiakban HSA) való peptidkötés létrehozásánál. Általános az a tapasztalat, hogy a szteroidok megh at ározására termelt antiszérumok legspecifikusabbak a szteroid molekula azon részére, amely „legtávolabb’’ van a fehérje kapcsolódási helyétől, és legkevésbé specifikusak azon részére, amelyhez a fehérjét hoozákótótték. Clikokólsav esetében a fehérjébe/ való kapcsolás eddig mindenesetben ágiiéin oldalláncon keresztül történt, így várható volt, hogy az antiszérum nem tud különbséget tenni a kólsav gljko és tauro-konjugáltja között, sőt a 7<*-hidroxil-csoport gátolt szférikus helyzete miatt a kenode/oxjkóisawal és konjugáltjaival is keres/treakciók várhatók. Az irodalmi adatok is ezt bizonyítják (Clin. Ciliin. Acta 54, 81 (1974); Gastroenetrology 65, 705 (1973) Felismertük, hogy ha az immunogénben a fehérje kötési helyéül nem a glidn oldalláncot, hanem a tőle térben legtávolabb lévő 3-as helyzetű Iridroxil-csoportot választjuk ki, a termelt antiszérum különbséget tud tenni a kólsav gliko és tauro-konjugáltja kozott. Ezen túlmenően a 3a-hidroxi-csoport kiválasztása azért is előnyös, mert az összes epesavban megtalálható, így az antiszérumnak erre a csoportra nem kel! specifikusnak lennie. Az immunogen előállításához szükséges haptén 3<>-liidruxilcsoportja azonban közvetlenül nem alkalmas a fehérjével pepiid-, vagyis savamid-kötés létreh/.ására, ezért a 3a-hidroxíl-csoportot borostyánkősavval szelektíven aeileztük. A/ így kapott hemiszukcinát szabad karboxil-csoportja már felhasználható volt peptidkotes kialakítására Biztosítani kellett a glicin karboxil-csoportjának védelmét, hogy a BSA-kótés a későbbiekben ne ezen a helyen menjen végbe. A glicin kaboxil-csoportjának védelmét észterképzéssel oldottuk meg. Az (I) képletű haptént oly módon állítottuk elő, hogy a glikokólsav -metil-észtert borostyánkősavanhidriddel acetonitrilben szobahőmérsékleten 3 napon át aeileztük. A spektroszkópiai adatok igazolták, hogy a glikokólsav további hidroxil-csoportjai (7a és 12a) ilyen körülmények között nem acileződtek. Az ilyen módon előállított 3a-(3-karboxi-propionil)-glikokólsav-metíl-észtert haplénként használtuk új immunogén előállításához. A haptént — ismert módon - az Erlanger és munkatársai (J. Bioi. Client. 228 713 (1957) által leírt vegyesanhidrides módszerrel kapcsoltuk a fehérjéhez, előnyösen bovin szérum albuminhoz (BSA), de a kapcsolás l-etil-3- (3-díetilamino-propil) -karbodünúd-iiidrokloriddal (J. Steroid Bíochem. 13, 449 (1980) is elvégezhető. Mivel azonban a haptén új szerkezetű, a reakciókörülményeket módosítanunk kellett. Igv a kiindulási reakció elegyben az. 1 mól fehérjével reagáló szteroid mennyiségét 40 mólról 100 mólra emeltük, valamint a reakció lefolyása alatt ügyeltünk arra, hogy' a reakdóelegy pH-ja 8,3 8,5 legyen. Fehérje komponensként alkalmazhatunk humán szérum aíbumint (USA) vagy egy megfelelő mólsúlyú pepiidet is. Az így előállított immunogént dialízissel (0,01 mól foszfát puffer, pll-- 7,4) megtisztítottuk, majd a fehérje molekulákhoz kapcsolódó glikokólsav molekulák számát — Hidalt glikokólsavnak a kiindulási re akcióé le©» ben és a dializáit végtermékben lévő arányából - meghatároztuk. Egy molekula fehérjéhez, a fenti módon például 16 molekula hapten (új gükokólsav-származék) kapcsolódott. Az. immunogén fenti foszfát-pufferes oldatának aliquotjait (100 /jg immun ogén tartalmúak) felhasználásig lefagyasztottuk ( 20°C-on). A fenti módon 3a-(3-karboxi propionil) -glikokól sav-metil-észtert kapcsoltunk BSA-hoz vegyesanhidrides módszerrel. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás a (II) általános képletű ahol X NH egy immunogének előállítására alkalmas feliérjemaradék — új immunogén előállítására, amely abban áll, hogy az (1) képletű haptén karboxilcsopotja és egy alkalmas X NI 12 kcpletű fehérje molekula amino csoportja között a peptidkémidban ismert módon savamid kötést létesítünk, miközben a reakcióelegy plí-ját 8,3 és 8,5 között taitjuk. A találmány további alapja az. a felismerés, hogy a fenti módon előállított új immunogénnel immunizálunk specifikus antiszérum termelése céljából. A találmány szerinti eljárással előállított új immunogén (3a- (3 karboxi-propionil) -glikokolsav-meti) észter B,SA k0juj5.it) aliquotját immunizáláskor fiziológiás kony has óoldat ta i 0.5 ml-re hígítottuk és Freund komplett adjutánssal 1:1 arányú emulziót állítottunk elő. Az immunizálást az irodalomból ismert módon (Gastroenterology 65, 705 (1973); Clin. Cilim. Acta 72, 39 (1976) hajtottuk végre az alábbiak szerint: Az immunizálandó állat, pl. nyúl. juh, birka, disznó, ló stb. -- előnyösen nyúl — hátának 10 különböző helyére intradcrmdlisan adtuk az immunogént 4 héten át heti egy alkalommal, majd havonként emlékeztető (booster) immunizálást végeztünk. A termelődött antiszérum titerét és specifikusságát időről-időre triciált glikokólsav-tracerrel ellenőriztük, ezzel pár huzamosan a kereszt reakciókat is megvizsgáltuk. Az immunizálás kezdetétől számított 4. hónap végén az állatot szívpunkcióval elvéreztettük és az antis/érumot centrifugálással elkülönítettük. Az így kapott antiszérum specifikusságát a keresztreakdókkal jellemeztük, összehasonlítva az irodalomból ismert legjobb (C) és forgalomban lévő reagens-készletek (A,B) keresztreakcióival. Példaként a nyólból nyert an tiszé - nmi jellemzőit az. 1. táblázatban adjuk meg. A táblázat adataiból látható, hogy a találmány szerinti antiszérum gyakorlatilag glikokólsavra monospecifikus. \ glikokólsawal adott keresztieakciókat 100%-nak •éve, Abralrain, G.E. módszere szerint értékelve (J. Clin. Endocrinol 29 , 866 (1969) az. egyéb epesavakkal végbemenet keresztreakciók mértéke 2—3 nagyságrenddel kisebb. Mivel a nyulak közli biológiai szórás miatt - a nyert antiszérumok specifikussága azonos immunizálás esetén sem egyforma, az új iinrnunogén alkalmazása esetén követelményként szabható meg, hogy a keresztreakciók értéke egy-egy epesavra nézve maximálisan a glikokólsavra mért élték 10%-a legyen. Ezt a követelményt ajódozott tracerp’l nyert eredményei is kielégítik. A radioiimnun-meghatározáshoz szükséges reagenskészlet másik fő komponense a tracer. A tracerek a haptének aminosavakkal illetve aniinokkal alkotott kanjugátumai; amelyek jelezhetőek pl. 12 5 I da! vagy 1511-dal. A tracerekben — az immunogénekhez hasonlóan — a liapíc ck és aminosavak, illetve aminok között peptidkotést létesítünk. E célra leggyakrabban h.isznált aminosavak és aminok a következőek: tiro-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
