194284. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és in-vitro reagens-készlet glikokólsav meghatározására
1 194 284 2 A találmány glikokólsav meghatározására, az ehhez szükséges in vitro reagens képletre, továbbá az immunogénnek és a reagens-készlet összetevőinek, a nagy specificitású anüszerumnak és tracemek előálli tására vonatkozik Közismert tény,hogy a szérumösszepesav koncentrációja a hapatobiliáris rendszer (máj, epehólyag és epeutak) megbetegedése esetén emelkedett szintet mutat. A primer epesavak, a kólsav (3a, 7a, 12a-trihidroxi- 5/3külán-24-karbon sav) és a kenodz.oxikólsav (3a, 7<frdihidroxi-5fíkolán-24-karbonsav) bioszintézise és konjugálódása glicinnel és taurinnal a májban történik, a konjugátumokat a máj valas/tja ki az. epével, melyek az epehólyagban raktározódnak. Innék az epeve/etékeu keresztül a duodenumba kerülnek, ahol lehetővé teszik a zsírok emulgeálását és abszorpcióját. A bélben az epesavak egy része dekonjugalódik, valamint a bél baktérium flórájának hatására dehidroxilálodik és úgynevezett szekunder eptsavakka, dezoxikólsavvá (3a, 12a-dihidroxi-5(3-kolán-24-karbonsav) illetve litokólsawá (3a-hidroxi 5/kko!án-24-karbonsav) alakul. Az epesavak kis része a széklettel távozik legnagyobb r sze azonban felszívódik a bélből és az enterohepatikus cirkuláció útján visszajut a majba. Egészséges egyéneknél a máj az epesavakat a potális keringésből kiszűri és mint konjugált primer epesavakat recirkuláltatja. Amennyiben a hepatodták (májsejtek) károsodnak, pl gyulladás, kémiai anyagok, stb. hatására, úgy képtelenek lesznek az epesavak felvételére, s emiatt a perifériás keringésben a primer epesavak koncentiációja megemelkedik. A szérum epesav koncentrációjának emelkedése arányos az érintett majsejtek károsodásának mértékével. Az epesavak mérésére számos módszert fejlesztettek ki, többek kozott a gázkromatográfiás (GLC), a nagynyomású folyadékkromatográfiás fllPLC) és a gázkromatográfiás tomegspektrográfias (GC MS) módszert. Ezek közös hátránya, hogy érzékenységűk nem kielégítő, emiatt a meghatározás okhoz nagytérfogatú szerűm minta szükséges, a minták előkészítése munka , idő- és vegyszerigényes, valamint a mérőműszerek drágák. A rutin orvosi diagnosztika céljára csak az a vizsgá lati módszer alkalmas, amely megfelelő érzékenységű, viszonylag gyors cs nagyszámú szérum-minta egyidejű mérését teszi leh* tővé. Ezen követelményeket epesavak mérésekor a .adioimmun-meghatáiozás (a továbbiakban RIA) kielégíti Az első RlA-módszert az egyik príméi epesav, a kólsav konjugált származékainak meghatározására Simmonds cs mtsai Írtak le 1973-ban (Gastroentero,ogy 65, 705 (1973). Ezt kővetően számos kutatócsoport foglalkozott a módszer továbbfejlesztésével, illetve i' is epesavakra történő adaptálásával (Clin. Chim. Acta 54, 81 (1974), 72, 39 (1976); J. Steroid Bioo hem 13,444(1980) A radioimmun meghatározás elterjedése lehetővé tette, hogy széleskörű klinikai vizsgálat induljon meg. Ezek a vizsgálatok igazolták, hogy az epesavak szérumszintje érzékenyebb indikátora a hepatobiháris megbetegedéseknek, mint a tradicioná lis májlunkciós vizsgalatok, pl. a BSP retenció, protrombin idő, szérum bilirubin, szérum öss/fehérje, alkalikus foszfa.az és a transzamináz meghatározása (N. Engl. J. Med. 293,1209 (1975). A heprtobiháris rendszer bizonyos megbetegedéseinek diagnosztizálására alkalmas lehet az összepesavszint meghatározása is, általánosan elfogadott azonban az. a nézet, hogy speciális epesavak szérumszintjé nek megadása alapján pontosabb diagnózis állítható fel. Japán kutatok például szekunderepesav-konjugátumok, Így a glikolitokólsav (3a-hidroxi-50 -24-oxokoMn-24-il-glicin) és a szulfoghkolitokólsav (3a-szul foniloxi -5/3-24-o\o-kolán -24-il-glicin) meghatározására dolgoztak la nagyérzékenységű módszert, kaptánként 3-(0-karboxi-metfl)-oxim-származékot alkalmazva (Steroids 41,165 (1983). A legtöbb kutatócsoport által kifejlesztett módszer azonban főleg az egyk primer epesav glíko-konjugáltjára, a glikokólsav (3a, 7a, 12a-trihidroxi -50-24-oxo-kolán-24-il-giidn) meghatározására iiányul, mivel a máj a glikokolsavat képes a legnagyobb mértékben, mintegy 80- 907^ban a portális keringésből kivonni. Ezért a hepatocitak károsodásának legérzékenyebb indikátoraként a giíkokolsav-szánt megváltozását tekintik (Clin. Chem 1/10, 1698 (1981). A glikokólsav neghatározásának fontosságát támasztja alá az a tény is, hogy a glikokólsav az az epesav, amely — eltérően a szabad kólsavtól és a monohidroxi- és diliidroxi epesavak konjugá tu maitól — a ternunáhs Hetimből aktív transzport útján szívódik fel. Így a malabszorpciót, a Chron betegséget, a stagnant loop syndromát stb a glikokólsav csökkent s/érumszintje alapján diagnosztizálni lehet (J. Pediatrics 96/3,582(1980). Ismeretes, hogy a radioimmun vineghatáiozáshoz szükséges egy reagens-készlet, melynek egyik fő komponense az immunizítás eredményeképpen nyerhető antiszérum. Az auUs/émmókát három tulajdonságukkal: a titerukkel, affinitásukkal és specifikusságukkal jellemzik. Az epesavak mérésére előállított antiszérumok legfőbb hiányos-'.iga. hogy nem eléggé specifikusak, így a mérendő epesavon kívül egyéb epesavakat is mérnek azáltal, hogy a szérumban előforduló egyéb epesavakka! is végbemegy az an tigén-antnes. komplexképzés, azaz keresztreakció. A nemkívánatos keresztreakciók az epesavak meghatározásakor azért jelentenek különösen nag problémát, mert a szárúmban a négy fő epesav (k.risav, kenodezoxikólsav, dezoxikólsav és litokólsav) mindegyike legalább három formában (szabad, gliko illetve tauro-konjugált foimábait) van jelen. Ezért az epesavak mérésével foglalkozó szakember számaia különleges feladatot jelent a kérésztreakciók kiküszöbölése, illetve csökkentése. A glikokólsav meghatározisára kifejlesztett RIA- mödszerek közös hátránya, hogy az alkalmazott antiszérumok nem tudnak különbséget tenni a gliko- vagy tauro-konjugált kólsav között, továbbá, hogy kisebbnagyobb mértékben a többi epesav közül is néhányat belemernek a glikokólsav értékébe. Enntk pedig az az oka, hogy az alkalmazott antiszérumok nem eléggé specifikusak (Gastroenterology, 72, 305 (1977). A fentiek alapjan a találmány célja eljárás kidolgozása az eddig ismerteknél specifikusabb antiszérum termelésére, amely alkalmas primer epesav konjugátumok, elsősorban glikokólsav meghatározására. Az eddig előállított antiszérumok nem kielégítő spedficitasa az immunizáláshoz használt immunogén szerkezetével hozható összefüggésbe. Tehát szükség volt olyan új fnimunogén előállítására amellyel spedfihusabb antiszérum termelhető. Az epesavak sztertyidok és így 1000-nél kisebb molkeulasúlyúak, aminek következtében önmagukban alkalmai lan ok immunválasz kiváltására ezért általában 5-iO 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
