194282. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, a B-lánc C-terminálisán módositott inzulin származékok és ilyeneket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194.282 2 A találmány tárgya új eljárás, módosított inzulinszármazékok, amelyek B-lánca C-terminálisan meg van hosszabbítva, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. Az inzulin-ArgB3'-OH, inzulin-Arg“31-Arg“32- OH, valamint más, a B-láncokon C-terminálisan bázison modifikált inzulin-származékokból előállított gyógyszerkészítmények speciális adalékanyagok, így például Surfen'' vagy Protamin adalékanyagok alkalmazása nélkül is igen jó depotulajdonságokat mutatnak. Ilyen származékok előállítását, valamint a készítményeket és alkalmazásukat ismertetik például a találmányi bejelentés napja uán publikált 33 26 472, 33 26 473, 33 27 709, 33 27 928 számú nyilvánosságrahozatali iratok. Az ilyen késleltetett hatású inzulin-készítmények előnye mindenekelőtt a jó elvisehetőség, ami az inzulin-kezelések hosszú időtartama miatt mindenekelőtt a depó segédanyagok hiányzó Immunhatásával magyarázható. Az inzulin bioszintézise során egy közvetlen intermedierből, az egyláncú proinzulin, az un. ,.Connecting Peptid” enzimatikus hatásával képződik a kettősláncú inzulin. A reakció nem tőkéles végbemenetele során azonban ún. közbenső-inzulin (intermedier-inzulin) is kimutatható igen kis mennyiségben az izolált, nyers inzulinba. Ezen köztitermékek szerkezete ismert, túlnyomórész B31-Arg- és B31-32-Arg-Arginzulin-származékok. lia a szarvasmarhákból, sertésekből, vagy emberekből származó proinzulint tripszinnel kezeljük, (Change. Excerpta Medica International Congress Series 231. szám, 297. oldaltól) a megfelelő dezoktapeptid- B23-30-inzulin mellett mindenekelőtt B31-Arg- és B32-Arg-Arg-inzulin keveréke képződik. Ezeknek a termékeknek az elválasztása és tisztítása igen munkaigényes, általában többszöri ioncserés kromatografálást igényel, és így nagy a veszteség. így gyógyászati célra elegendő mennyiségű anyag kinyerése a nyers inzulinból gyakorlatilag nem megoldható. További nehézséget jelent, hogy a humáninzulinnak megfelelő termékek nem állnak rendelkezésre. Ilyen származékok előállítására alkalmazható eljárás, ha a proinzulint vagy azok analógjait géntechnológiai úton állítjuk elő, majd enzimatikusan hasítjuk, a tisztítási folyamatnál azonban itt is igen nagyok a veszteségek. Találmányunk célja olyan új eljárás biztosítása, amely segítségével egyszerű módon állíthatók elő az új típusú galenikus készítményekhez szükséges menynyiségben bázison modifikált inzulin-származékok. A célkitűzésben megjelölt feladatot úgy oldottuk meg, hogy olcsó, bioszintetikus úton nert inzulinból, így humán inzulinból, sertésinzulinból vagy adott esetben ezek elővegyületeiből (prekurzorjaiból) alkalmas peptid-származékok felhasználásával, enzimakatlizált átalakítással állítottuk elő a kívánt terméket. Az utóbbi években különböző kémiai és enzimatikus eljárások váltak ismertté, amelyek segítségével például a sertésinzulin átalakítható (Biochem. J. 211, (1983) 671-676, 3 903 068, 3 276 961 és 4 320 197 számú amerikai szabadalmi leírások, a 2 069 502 számú angol és 56 951 számú európai bejelentés közzétételi iratai, stb ), továbbá olyan eljárások, amelyekkel például a megfelelő pre-proinzulin-származékok és íntermedier-inzlinok átalakításával például humán inzulin nyerhető (például P 32 09 184 számú NSZK beli nyilván csságrahozatali irat.) Meglepetésre azt találtuk, hogy a B29 helyzetben lizin-csoportot tartalmazó inzulin szelektív transzamidálása olyan peptidekkel, amelyek Arg- illetve Arg-Arg -csoportokat tartalmaznak, nagy kitermeléssel hajtható végre, akkor is, ha az inzulin a B22 helyen Alcsoportot tartalmaz. Ugyanez vonatkozik a proinzulinra (ahol az A-lánc O-ik helyén Lys-Arg-csoport van és analógjaira is. A találmány a fentiek alapján (I) általános képletű új inzulin-származékok új előállítási eljárására vonat kozik, amelyek képletében R1 jelentése hidrogénatom vagy H—Plie, és R30 jelentése L- vagy D-konfigációjú és Arg-OH vagy Arg-Arg-OH, és amelyek izoelektromos pontja 5,8 feletti érték. A találmány szerinti eljárásnál úgy járunk el, hogy a) (I) általános képletű inzulint, amelynek képletében R* jelentése hidrogénatom, vagy H—Phe, R30 jelentése Thr és R3 1 jelentése hidroxilcsoport vagy karboxi-védőcsport, vagy b) sertés proinzulint (III) általános képletű H-R30—R3' peptid- vagy aminosav-származékkal, a képletben R30 és R31 jelentése a fenti és a fenti vegyuletekben az aminocsoportok adott esetben védve lehetnek, — reagáltatjuk, tripszin vagy tripszinnek megfelelő olyan endopeptidáz jelenlétében, amely a Lys és Arg karboxilcsportján hasít, vizes közegben, adott esetben alkalmas szerves oldószer adagolása mellett, az inzulin izoelektromos pontja alatti pH-értéken, előnyösen 5,4 alatt, és adott esetben a védőcsoportokat eltávolítjuk. Különösen előnyösek azok a találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű veeyületek, amelyekben R1 jelentése H-Phe és/vagy R3^ jelentése Tlire, továbbá amelyekben az A-lánc és a B2—30 láncok a humán inzulin szekvenciájának felelnek meg. A találmány szerinti eljárással például a következő vegyületeket állítjuk elő: Des-PheB1 -sertésinzulin-Arg®3 '-OH Des-PheB1 -hujmán inzulin ArgB3 1 -OH Des-PheB1 -sertésinzulin-ArgO31 -ArgB3 3-OH Des-Phe®1 -humáninzuhn-ArgB31 -ArgB3 2 -OH Sertésinzulin-ArgB3 ' -OCH3 Humáninzulin-ArgB31 -OCIU Szarvasmarha inzulin-ArgB3 *-OCII3 Sertésinzulin-ArgB31 - ArgB3 2-OCH3 Humáninzulin-ArgB31 - ArgB3 2 -OCH3 Humáninzulin-D-ArgB31 -OH Humán inzulin-D-ArgB31 - ArgB3 3-OH Humáninzulin-ArgB 1 -D-ArgB32 oh Humán inzulin-Argin inolB31 Humáninzulin-ValB31 -ArgB3 2 -OH Humáninzulin-ArgB31 -Argininolb32 Humáninzulin-ArgB31 3-amino-tetrahidrofurán-2-on Humáninzulin-ArgB31 ArgB3 J-3-amíno-tetrahidrofurán-2-on Humáninzulin-ArgB31 NHj Humáninzulin-ArgB31 -Arg“32 -NH2 Humáninzulin-(B30)-NH-CH2-CHj -NH2 Humáninzulin-(B30)-NH-CH2-CH2-NH2 Humáninzulin-ArgB31 -O-CHj -CHj -NHa Des-ThrB30 humán inzulin-ArgB3 ®-OH Humán inzulin-ArgB31 .ç h2 -C H2 9-N(CH3 )a Humámnzulin(B30)-O-CH2-CH2-N(CH3)3 Humáninzulin-(B30>NH-CH2-CH,-N(CH3)3 Des-ThrB30-humáninzulin-ArgB3“-ArgB3 ‘-OH 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
