194282. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, a B-lánc C-terminálisán módositott inzulin származékok és ilyeneket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 282 2 különösen Humáninzulin-Arg1*3 ‘ OH Humáninzulin-ArgB3 ‘-Arg®3 3-OK Azok a csoportok, amelyeket a találmány szerinti eljárás során adott esetben a B-lánc C-terminális karboxilcsoportjának védésére alkalmazunk, mindenekelőtt észter- és amídcsoportok, előnyösen (C( —C6)alkoxi-, (Cj —C6)-cikloalkoxi-, NH2~, (Cj-C6)-alkilantino-, Di-(Ci-C6)-alkil-amino- vagy bázisos csoportok, mint például amino-(Ci—C6)-alkoxi-, (Cj— C4)alkil-antino-(C2—C6)-alkoxi-, Di-(Cj — C^-alkil-amino-(C2-C6)-alkoxi-, tri-(Ci--C4)-ammonio- (C2—C6)-alkoxi-, anáno-(C2—Cé)-alkil-amino-, /(C, — C4)-alkilanáno/ -(C2-C6)-alkil-amino-, /di-(Ci-C4)-alkil-amino/ -(C2-C6)-alkil-amino-, vagy /tri-(C,-C4) -alkilammonio/ -(C2-C6)-alkil-amino-, különösen -O(CH2)p-NR2-, -0-(CH2)p-NR3-, -NH-(CH2)p-NR3- csoport, aliol p = 2-6 és R azonos vagy különböző és jelentése hidrogénatom vagy (Cj —C4)-alkil-csoport, Inzulinként alkalmazhatunk bármely Lys (B29) tartalmú természetből izolálható, előnyösen sertésekből vagy emberekből izolált inzulint vagy proinzulint. Pre-propinzulinként mindenekelőtt a géntechnológiai úton előállítottak jönnek számításba, amelyek a preszekvenérájukban a megfelelő kódolás útján a molekula BO helyzetében egy bázikus amin osav-csoportot tartalmaznak és amelyek tripszinnel vagy ripszinnek megfelelő szabad vagy hordozófixált enzimmel leírási thatók. A találmány szerinti eljárásnál PheB1-inzulin kiindulási vegyületként alkalmazhatjuk például a 20 05 058 számú NSZK-beli szabadalnú leírásból vagy a 46 979 számú európai bejelentés közzétételi iratából ismert vegy öleteket. Géntechnológiai eljárásokkal kiindulási vegyületek céljára humán-vagy emlős-proinzulinokát nyerhetünk. Ezek mellett azonban még viszonylag egyszerű plazmidok is képződnek, amelyekből a megfelelő pre-proinzulin-származékok lehasításával új inzulin-származékok keletkeznek, mivel ezek a természetes B31 és B32 láncon található arginin helyett más semleges vagy bázikus aminosavat kódolnak. A rekombináns DNS-technológia alkalmazásával való proinzulin előállításhoz egy proinzulin-aminosavszekvenciának megfelelően kódolt DNS-szekvenda kialakítása szükséges, akár izolálás, akár konstrukdó vagy e kettő kombinációjának segítségével. A proinzuBn-DNS-t ezután a begyűjtés fázisában alkalmas kolinizáló- vagy expresszió-hordozóval iktatjuk be. A hordozó a megfelelő mikroorganizmus transzformálására szolgál, amelyet ezután fermentádós eljáásnak vetünk alá, amikoris a proinzulin-tartalmú vektor egy további másolata és a proinzulin, egy dik. Amennyiben az expressziós termék egy proinzulinprekurzor, akkor ez a termék általában a proinzuiinaminosav szekvenciát tartalmazza, amely a végállású a min ocsoportján keresztül egy fehérjeszegmenshez kapcsolódik, amely normál esetben génszekvenciával van kifejezve és amelyben proinzulint vagy proinzulin-származékot alkalmaztunk. A találmány szerinti eljárásnál az en/im-katalizált reakciónál pepiidként vagy aminosav-származékként mindenekelőtt adott esetben az oldalláncokon és a kaboxilvégcsoportjukon védett di-, tri- és tetrapcptideket alkalmazunk, amelyek N-terminális végcsportként Gly-t, Lr vagy D-aminosavat tartalmaznak. Azok között, amelyek aminosav-karboxil-végcsoportja amidéit vagy észterezett, előnyös a kok n-ész ter, vagy a kvatemer-ammóniumcsoportot tartalmazó amid. Az aminosavak szabad COH-, OH-, SH-, cj-NH2-, guanido- és/vagy imidazol-csoportjai kívánt esetben a peptidkémiában ismert eljárások szerint védettek lehetnek (Bodanszky és társai: Peptide Synthesis, 2. kiadás (1976), John Wíley és Sons). A védőcsoportokat és a védési reakdó fajtáját az aminosav fajtájától és a C-terminális, karboxÜcsoportot blokkoló csoporttól függően választjuk meg. A találmány szerinti ejárásnál előnyösek azok a dipeptidek, amelyeknél az N-terminális treonilcsoport L(D-argininhoz kapcsolódik, és megfelelő, bázikus úton lehasítható védőcsoporttal védve van. Az L-/ vagy D-Arg, irreverzibilis karboxil-védőcsoportjaként báziskus diamint is köthetünk a pepiidhez. Ezek a dipeptidek különösen akkor előnyösek, amikor D-Arg aminosavat alkalmazunk, mivel ezeket a dipeptid-származékokat a sterszelektív tripszin vagy például a lizin-endopeptídáz-Lys-Ci nem ismeri fel és így az átalakítási reakciónál oldallánc védelemre nincs szükség. Aminokomponensként bázikus aminosavakat, így például D- és L-arginint és D- vagy L-liz.int is alkalmazhatunk. A megfelelő tripeptideknél a karboxilcsoportokon kívül az egyes oldallancoknak is savas vagy bázikus úton lehasítható védőcsoportokkal védettnek kell lenni. A D-aminosavak oldalláncvédelmét azonban úgy kell megválasztani, hogy az a reakciót követő tisztítási műveletet elősegítse. A fenti peptideket és aminosav-származékokat ismert eljárások szerint állíthatjuk elő (például ,,The Peptides Analysis, Synthesis, Biology , 1. kötet, Major Methods of Peptide Bond Formation, A rész, E. Gross J. Meierhofer szerkesztésében, Academic Press N.Y. (1979)”. A találmány szerinti eljárásnál a tripszínen kívül olyan endopeptidázokat is alkalmazhatunk, amelyek a bázikus aminosavak karboxilvégén lévő speciális peptidkötések hasítására képesek, (lásd például 17 938 számú európai bejelentés közrebocsátási iratát). Az enzimatikus átalakításhoz az aminosavakat, illetve peptidvegyületeket az inzulínkomponens menynyiségere számított 40—150-szeres feleslegben alkalmazzuk. Az enzimhordozó arány az inzulinra számolva általában 1:5 és 1:20 közötti érték, előnyösen 1:10. Mivel a találmány s/ennti eljárásnál az aminosavak és peptidvegyületek csekély vízoldhatóságűak, oldatba vitelük érdekében a reakcióközegben vízzel elegyedő szerves oldószereket, így példáui'metanolt, dimetil-formamidot vagy dioxánt alkalmazunk. A reakcióközegben azonban a víztartalom nem szabad hogy 50% alá essen, hogy az inzulin és/vagy tripszin kitermelés-csökkentő denaturálódása ntegakadályozható legyen. Az enzimatikus reakciónál a pH érték általában 4-5 közötti érték, előnyösen 4,5. Az említett tartománynál magasabb pH értéknél a kívánt átarnidálási reakciók az LysB2í helyeztben az ArgB33-nél bekövetkező nemkívánatos proteofitikus hasítások miatt visszaszorulnak. Előnyösek .vök a vegyületek, amelyekben R1 jelentése H-Phe .és/vagy az. A-lánc, valamint a (B2-29) láncok a humáninzulin szekvenciájának felel-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
