194281. lajstromszámú szabadalom • Kémiai eljárás az L 17392 antibiotikum (deglukoteikoplamin) és savaddíciós sói előállítására
1 194.281 2 bai tiszt« deglükoteikoplanint nyeljünk. így pl. az oszlopkromatográfiás tisztítást össze lehet kapcsolni egy bázis vizes oldatával vagy előnyösen egy szerves sav ammónium-sójának vizes oldatával történő érintkeztetéssel. Következésképpen egy előnyös tisztítási folyamat magában foglalja egy fordított fázisú oszlopkromatográfia alkalmazását. Ebben az esetben előnyös adszorbens a szilánozott szilikagél, amelynek részecskeméret-eloszlása 0,06-0,2 mm között van. Az eluálószer azok közül ahidrofil keverékek közül kerülhet ki, amelyeket ebben a tisztítási technikában alkalmazni lehet. Az ilyen hidrofil eluálószerekre reprezentatív példák a szerves savak ammóniumsói hígított vizes oldatainak és acetonitrilnek vagy vízzel elegyedő kis szénatomszámú alkanoloknak a keverékei. A szerves savak ammóniumsói hígított vizes oldataira reprezentatív példák a 0,l-6%^os ammóniumformiát oldatok, míg a megfelelő alkanolokra példák a metanol, etanol, propanol és hasonlók. Előnyös eluálószerek a vizes ammónium-formiát és acetonitril keverékei 6,5 és 7,5 pH között, vagy a vizes ammóniumformiát és a metanol keverékei. Különösen előnyös a nyers deglükoteikoplanin só tisztításához az alábbiakat magában foglaló folyamat: a) a nyers deglükoteikoplanin savaddícióssóinak0,2% vizes ammónium-formiát/metanol/butanl 1:2:3 arányú keverékével, vagy acetonitril/57% vizes ammonium fornáát 1:9 arányú keverékével képzett oldatát érintkezésbe hozzuk szilánozott szilikagéllelgs az oldószert leeresztjük, b) a szilánozott szilikagél (0,06—0,2 mm) oszlop tetejénél levő maradékot alkalmazva az oszlopot kifejlesztjük 0,6%-os vizes ammóniumformiát/acetonitril 9:1 arányú keverékével, az eluátumot elöntjük, majd folytatjuk az eluálást acetonitril vízben képzett lineáris gradiensével, ahol a gradiens 1:9-től 3:7-ig tart, 200 ml/óra sebességgel 30 órán át. Az így nyert termék lényegében tiszta deglükoteikcplanin, amely kielégítő fizikokémiai és biológiai jellemzőket mutat az alább leírt felhasználásokban történő alkalmazáshoz. A lényegileg tiszta deglükoteikoplanin HPLC-titere nagyobb, mint 95% (százalékos csúcs területek, 254 mm ultraibolya hullámhossznál), víz és oldószertartalma 10 és 15 tömeg% között van és a szervetlen maradék kevesebb, mint 0,5 tömeg%. A kristályos (tűk) tiszta deglükoteikoplanint a fenti lényegében tiszta deglükoteikoplanin készítmény víz/acetonitril 9:1 arányú keverékben történő felszuszpendálásával, majd a pH-nak ln HC1 hozzáadásával 1,7 értékre történő beállításával nyerhetjük. Az így nyert oldatot azután egy szilánozott szilikagél oszlopra visszük, amelyet hígított (1%) tüzes ammóniumformiát oldattal stabilizáltunk és az oszlopot először vízzel mossuk, majd kifejlesztjük acetonitrilnek vízben képzett, 10%-tól 40%-ig teijedő gradiensével 70 ml/óra sebességgel 30 órán át. A frakciókat összegyűjtjük és HPLC-vel megvizsgáljuk. A tiszta teikoplanint tartalmazó frakciókat együtt gyűjtjük és 24 órán át állni hagyjuk, így tiszta, kristályos deglükotélkoplenin keletkezik. Ezt a folyamatot közvetlenül alkalmazhatjuk a nyers deglükoteikoplaninra vagy savaddídós sóira azokban az esetekben, ahol ezeket a hidrilizises reakcióból kielégítő tisztasági fokkal nyerjük ki. A fenti folyamat szerint nyert deglükoteikoplanin a következő jellemzőkkel rendelkezik: a) 9-nél nagyobb pH értéknél oldódik vízben, vizes metanolban, vizes etanolban és vizes acetonban, gyengén oldódik etil-alkoholban és dimetil-formamidban, b) ultraibolya abszorpciós spektrumai, amelyeket az 1. ábra mutat be, a következő abszorpciós maximumokat mutatják:- 0,ln sósav-oldatban: max = 279 nm(^‘^i = 87,1) — 0,ln nátrium-hidroxid-oldatban: max = 297nm -eV*TM=165,3) c) infravörös abszorpciós spektruma nojulban, amelyet a 2. ábra mutat be, a következő főleg szignifikáns abszorpciós maximumokat mutatja (cm-'): 3250 ( NH és fenolos OH) 1645 (I. amid) 1610 ( COO-) 1595 ( NH3+) ’ 1520 (II. amid), d) 270 MHz-nél Bruker WH-Í270 Spectrometer készüléken DMSO-d6-ban 50°C hőmérsékleten regisztrált lHNMR spektruma (belső standard TMS (tetrametilszilán, = 0,00 ppm) a 3. ábra szerinti. Néhány D20 kicserélés és szelektív szétcsatolási kísérletek utón nyert 1 HNMR«dat a következő: (ppm), sokszorozódás: 2,85—3,30, 2 dd, 4,12, dd, 4,37, d, 4,50, s, 5,00, ddd, 5,11, d, 5,14, d, 5,35, d, 5,56, d, 5,60, d, 6,3-7,9, m, 6,55, d, 7,37, d, 7,50, d, 7,61, d, 8,26, d, 8,28, d, 8,5-10,2, br, ahol djelentése dublett, dd jelentése dublettek dublettjei, ddd jelentése a dublettek dublettjeinek dublettje, s jelentése szingulett, m jelentése multiplett, br jelentése széles, e) elem anilizise a következő hozzávetőleges százalékos összetételt mutatja (átlag): szén, 58,05%, hidrogén 3,58%, nitrogén 8,23%, klór 5,85%, (termogravimetriás analízissel 11%-nak mért tömegveszteséggel történő korrekció után), f) molekulatömege 1199, gyors atombombázós/tömegspektrometriás analízissel (Fast Atomic Bomardment/Mass Spectrometry, FAB—MS) megerősítve, g) képlete (a rendelkezésre álló adatok alapján kalkulálva) CsgHtjC^NjOig, h) retenciós ideje (tp) 12,2 perc, amikor HPLC-vel elemezzük Perisorb RP8-al (30 m, Merck) töltött elő-oszlopot (5 cm) alkalmazva, majd Lichrosorb RP8-al (10 m) előtöltött Hibar RT250-4 (Merck) oszlopot alkalmazva és 0,2%-os vizes ammónium formiátban 10%-tól 30%úg terjedő lineáris-lépcsőzetes acetonitril gradienssel eluálva 2 ml/perc átfolyási sebesség mellett (a referenciaként használt teikoplanin A2 alkotórész 2. komponense (a 2121401 számú brit szabadalmi közrebocsátási irat szerinti termék) tj^ értéke 22,4 perc ebben a rendszerben), i) egy savas funkciója van, amely képes sókat képezni, és l) egy bázisos funkciója van, amely képes sókat képezni, és m) nincs cukor-maradéka. A fizikokémiai adatok alapján és más glikopeptid antibiotikum vegyületekkel, mint pl. a vankomicin-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
