194280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Új, nagy hatékonyságú gonaldoliberin-analógok és az ezeket tartalmazó gyógyaszati készítmények előállítására
1 2 majd triciumgázt vezetünk hozzá. Ezután a reakcióelegyet 0 °C-ra melegítjük és 30 percig keverés közben triciáljuk. Ezután a felesleges triciumgáz elvezetjük, a reakcióelegyet 10 ml 0,1 mól/1 ecetsav-oldattal hígítjuk, szűrjük, végül az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A terméket analitikai nagynyomású kromatográfiás oszlopon (5 ^m szemcseméretű Shandon ODS-Hypersyl töltet, 25 x 0,5 cm-es oszlop) 43 tf% metanol és előzőleg 4,0 pH-ra beállított 57 tf% 0,1 mól/1 ammónium-acetát/ecetsav puffer elegyével tisztítjuk. így mintegy 1—2 Ci/mM fajlagos radioaktivitású jelzett anyagot kapunk, amelynek a radioaktivitáson kívül minden fizikai és kémiai jellemzője megegyezik a nem radioaktív termékével (1. példa c. rész terméke). 8. p é 1 d a Glp-His—Trp—Ser—Tyr—Asp(OMe)—Leu—Arg—Pro— Gly—NH2 —bisz(trifluor-acetát) a) Z—Asp(OMe)—Leu—Arg(N02 )— Pro—Gly—NHj 1,26 g (2,8 mmól) Z—Asp(OMe)—OPFP 20 ml dimetil-formamiddal készített oldatát 0 °C-ra hűtjük, majd keverés közben 1,37 g (2,3 mmól) H—Leu— Arg(N02)-Pro— Gly—NH2-trifluor-acetátot és 0,39 ml (2,8 mmól) trietil-amint adunk a reakcióelegyhez. Két óra múlva lassan hozzácsepegtetünk még 0,39 ml (2,8 mmól) trietil-amint és a keverést még egy éjszakán át folytatjuk 0 °C-on. Ezután a kivált sót kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk és a maradékként kapott olajszerű anyagot 80 ml etil-acetát és 25 ml 1 mól/1 vizes kálium-hidrogén-szulfát-oldat keverékében oldjuk. A szerves fázist elválasztjuk és kétszer 20 ml 1 mól/1 vizes kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, majd háromszor 20 ml telített vizes nátrium-klorid-oldattal kirázzuk, vízmentes magnézium-szulfáttal szárítjuk, szüljük és szárazra pároljuk. Az így kapott olajos anyagot 20 ml etil-acetátban oldjuk és lassú ütemben 200 ml petrolétert csepegtetünk hozzá. A kivált anyagról a petrolétert dekantáljuk, majd a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szárítás után 1,27 g (74%) cím szerinti terméket kapunk. Móltömeg: 748. Rf2 = 0,61 ; Rf9 = 0,20; Rf12 - 0,66. b) H-Asp(OMe)—Leu—Arg— Pro—Gly— NH2 -diacetát 1,1 g (1,47 mmól) Z—Asp(OMe)—Leu—Arg(N02) —Pro Gly-NH2 védett pentapeptid-amidot feloldunk 18 ml ecetsavban, majd 5 ml vizet és 200 mg 10%-os palládium-csontszén katalizátort adunk hozzá és ezután 6 órán át hidrogéngázt áramoltatunk keresztül a reakcióelegyen. Ezt követően a katalizátort kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, szárítjuk. így 0,91 g (90%) cím szerinti anyagot kapunk. Móltömeg: 689. Rf‘ = 0,07; R/ = 0,20; Rf6 = 0,49; Rr13 = 0,41. c) GIp-His-Trp—Ser—Tyr—Asp(OMe)-Leu—Arg- Pro—Gly-NH2 — bisz(trifiuoí-acetát) 26 mg (0,45 mmól) Glp—His-Trp-Ser-Tyr— N2H3 pentapeptid-hidrazidot feloldunk 3 ml dimetil-formamidban, az oldatot —15 °C-ra hűtjük és keverés közben 0,30 ml 6 inól/l diöxános hidrogén-klorid-oldatot (1,8 mmól) adunk hozzá. A reakcióelegy hőmérsékletét továbbra is —15 °C-on tartva keverés közben 31,2 mg (0,45 mmól) nátrium-nitrit tömény vizes oldatát adjuk hozzá, majd a reakcióelegyet további 15 percen át —15 és —20 °C közötti hőmérsékleten keverjük. Ezután 278 mg (0,41) mmól) H—Asp(OMe) —Leu—Arg—Pro—Gly—NH2 -diacetát 3 ml dimetilformamiddal készített és —15 °C-ra hűtött oldatát adjuk a fentiek szerint elkészített azid-oldathoz, majd rögtön ezután 0,25 ml (1,8 mmól) trietil-amint adunk hozzá. Ezt követően fél órán át —10 és —15 °C közötti hőmérsékleten, majd 48 órán át 0 °C-on keverjük a reakcióelegyet. Ezután a kivált csapadékot kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk és a bepárlási maradékként kapott olajos anyagot Sephadex G-25 töltetű (2,6 x 113 cm-es) oszlopon 0%-os, vizes ecetsav-oldattal tisztítjuk. Az elúciót az UV abszorpció mérésével (287 nm-en), illetve vékonyréteg-kromatográfiásan követjük. A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat bepároljuk, a maradékot liofilizáljuk. így 520 mg nyers, cím szerinti pepiidet kapunk. Ezt a fentiekben megadott módon tovább tisztíthatjuk Sephadex G—25 tölteten. Ennek során a cím szerinti pepiidet tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, majd a maradékot liofilizáljuk. 314 mg terméket kapunk, amit középnyomású folyadékkromatográfiával tovább tisztítunk. Fordított fázisú, 18 szénatomos alkil-csoportokat tartalmazó, Whatman LRP-1 jelű, 13—24 *rm szemcseméretű töltetet és 2,5 x 40 cm méretű oszlopot használunk. Oldószerként i-propanol és 0,1 %-os, vizes trifluor-ecetsav-oldat elegyét használjuk. A szerves komponens arányát 2%-ról 23%-ra növeljük a gradiens-alúció folyamán. 400-400 ml aluens térfogatot használunk. A tiszta frakciókat egyesítjük, bepároljuk, majd liofilizáljuk. így 240 mg (39%) tiszta, cím szerinti pepiidet kapunk. Móltömeg: 1483. Rf6 = 0,554; R^0 = 0,62; Rf’3 = 0,57. 9. példa Glp—His—Trp—Ser—Tyr—Asu—Leu—Arg—Pro-Gly— NH2 -dihidroklorid 30 mg 8. példa szerint előállított Glp—His—Trp— Ser—Tyr—Asp(OMe)—Leu—Arg—Pro—Gly—NH2-bisz(trifluor-acetát) sót feloldunk 8 ml dimetil-formamidban és 1,2 ml trietil-amint adunk hozzá, majd az oldatot 20 °C-on 72 órán át állni hagyjuk. Ezután a reakcióelegyet bepároljuk, majd rögtön ezután 30 ml ecetsavat adunk hozzá és ezt is lepároljuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük, az étert dekantáljuk és a kapott szilárd anyagot megszárítjuk. A kapott száraz anyagot 5 ml desztillált vízben feloldjuk, majd az oldatot liofilizáljuk, a liofilizátumot 5 ml 0,01 mól/1 vizes sósavoldatban oldjuk és az oldatot ismét liofilizáljuk. így 22 mg cím szerinti pepiidet kapunk. Mól tömeg: 1296. R/ = 0,5; Rf10 = 0,5. 194.280 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
