194275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új epesav származékok előállítására
1 A találmány az (I) általános képletü új glikolókavszármazékok előállítására vonatkozik, melyek különösen alkalmasak, mint haptének, nagy spedfidtású anti szérum termelésére primer epesav meghatározásához. Közismert tény, hogy a szérum összepesavkoncentrációja a hepatobiliáris rendszer (máj, epehólyag és epeutak) megbetegedése esetén emelkedett szintet mutat. A primer epesavak, a kólsav (3a, 7a, 12a-trihidroxi-5/>kolán-24-karbonsav) és a kenodeoxikólsav (3a, 7odihidroxi-5/3-kolán-24-karbonsav) bioszintézise és konjugálódása glidnnel és taurinnal a májban történik, a konjugátumokat a máj választja ki az epével, melyek az epehólyagban raktározódnak. Innék az epevezetéken keresztül a duodenumba kerülnek, ahol lehetővé teszik a zsírokemulgeálását és abszorpdóját. A bélben az epesavak egy része dekonjugálódik, valamint a bél baktériumflórájának hatására dehidroxilálódik és úgynevezett szekunder epesavakká, deoxikólsavvá (3a, 12a-dihidroxi-5/3-kolán-24-karbonsav) illetve litokólsavvá (3a-hidroxi-5/3-kolán-24karbonsav) alakul. Az epesavak kis része a széklettel távozik, legnagyobb része azonban felszívódik a bélből és az enterohepatikus cirkuláció útján visszajut a májba. Egészséges egyéneknél a máj az epesavakat a portális keringésből kiszűri és mint konugált primer epesavakat recirkuláltatja. Amennyiben a hepatociták (májsejtek) károsodnak, pl. gyulladás, kémiai anyagok stb. hatására, úgy képtelenek lesznek az epesavak felvételére, s emiatt a perifériás keringésben a primer epesavak koncentrációja megemelkedik, A szérum epesavkoncentrációjának emelkedése arányos az érintett májsejtek károsodásának mértékével. Az epesavak mérésére számos módszert fejlesztettek ki, többek között a gázkromatográfiás (GLC), a nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) és a gázkromatográfiás tömegspektrográfiás (GC—MS) módszert. Ezek közös hátránya, hogy érzékenységük nem kielégítő, emiatt a meghatározásokhoz nagytérfogatú szérum-minta szükséges, a minták előkészítése munka-, idő- és vegyszerigényes, valamint a mérőműszerek drágák. A rutin orvosi diagnosztika céljára csak az a vizsgálati módszer alkalmas, amely megfelelő érzékenységű, viszonylag gyors és nagyszámú szérűmmminta egyidejű mérését teszi lehetővé. Ezen követelményeket epesavak mérésekor a radioimmun-meghatározás (a továbbiakban R1A) kielégíti. Az első Rí A-módszert az egyik primer epesav, a kólsav konjugált származékainak meghatározásra Simmonds és mtsai írták le 1973- ban (Gastroenterology 65, 705 (1973). Ezt követően számos kutatócsoport foglalkozott a módszer továbbfejlesztésével, illetve más epesavakra történő adaptálásával (Clin. Chim. Acta 54,81 (1974), 72, 39(1976), J. Steroid Biochem. 13, 449 (1980). A radioimmunmeghatározás elterjedése lehetővé tette, hogy széleskörű klinikai vizsgálat induljon meg*. Ezek a vizsgálatok igazolták, hogy az epesavak szárumszintje érzékenyebb indikátora a hepatobiliáris megbetegedéseknek mint a tradicionális májfunkciós vizsgálatok, pl. a BSP retendó, protrombin-idő, szérum-bilirubin, szérum-összfehérje, alkálikus foszfatáz és a transzamináz meghatározása (N. Engl. J. Med. 293,1209 (1975). < A hepatobiliáris rendszer bizonyos megbetegedéseinek diagnosztizálására alkalmas lehet az összepesavszint meghatározása is, általánosan elfogadott azonban az a nézet, hogy spedális epesavak szérumszintjének megadása alapján pontosabb diagnózis állítható fel. Japán kutatók például szekunder epesav-konjugá-2 tumok, így a glikolitokólsav (3a-hidroxi-5/324-oxokolán-2-4Ü-glian) és a szulfoglikolitokólsav (3a-szulfoniloxi-5/3-24-oxo-kolán-24-il-glicin) meghatározására dolgoztak ki nagyérzékenységű módszert, hantánként 3-(0-karboxi-metil)-oxim-származékot alkalmazva (Steroids 41, 165(1983). A legtöbb kutatócsoport által kifejlesztett módszer azonban főleg az egyik primer epesav güko-konjugáltjára a glikokólsav (3a, la, 12a-trihidroxi-5j3-24-oxokolán-24-il-glidn) meghatározására irányul, mivel a máj a glikokólsavat képes a legnagyobb mértékben, mintegy 80-90%-ban a portális keringésből kivonni. Ezért a hepatociták károsodásának legérzékenyebb indikátoraként a glikokólsav-szint megváltozását tekintik (Clin. Chem. 27/10,1698 (1981). A glikokólsav meghatározásának fontosságát támasztja alá az a tény is, hogy a glikokólsav az az epesav, amely — eltérően a szabad kólsavtól és a monohidroxi- és dihidroxi-epesavak konjugátumaitól - a terminális ileumból aktív transzport útján szívódik fel. így a maiabszorpciót, a Chron-betegséget, a stagnant loop syndromát stb. a glikokólsav csökkent szérumszintje alapján diagnosztizálni lehet (J. Pediatrics 96/3,582(1980). Ismeretes, hogy a radioimmuno-meghatározáshoz szükséges egy reagens-készlet, melynek egyik fő komponense az immunizálás eredményeképpen nyerhető antiszérum. Az antiszérumókát három tulajdonságukkal: a titerükkel, affinitásukkal és spedfikusságukkal jellemzik. Az ''epesavak mérésére előállított antiszérumok legfőbb hiányossága, hogy nem eléggé spedfikusak, így a mérendő epesavon kívül egyéb epesavakat is mérnek azáltal, hogy a szérumban előforduló egyéb epesavakkal is végbemegy az antigén-antitest komplexképzés, azaz keresztreakdó. A nemkívánatos keresztreakciók az epesavak meghatározásakor azért jelentenek különösen nagy problémát, mert a szérumban a négy főepesav (kólsav, kenodeoxikólsav, deoxikólsav és litokólsav) mindegyike legalább három formában (szabad, gliko- illetve tauro-konjugált formában) van jelen. Ezért az epesavak mérésével foglalkozó szakember számára különleges feladatot jelent a keresztreakciók kiküszöbölése, illetve csökkentése. A glikokólsav meghatározására kifejlesztett RIA- módszerek közös hátránya, hogy az alkalmazott antiszérumok nem tudnak különbséget tenni a gliko- vagy tauro-konjugált kólsav között, továbbá, hogy kisebbnagyobb mértékben a többi epesav közül is néhányat belemémek a glikokólsav értékébe. Ennek pedig az az oka, hogy az alkalmazott antiszérumok nem eléggé spedfikusak (Gastroenterology, 72, 305 (1977). A találmány célja olyan új haptén előállítása, melylyel az eddig ismerteknél spedfikusabb antiszérum termelhető, amely alkalmas primer epesav-konjugátumok, elsősorban glikokólsav meghatározására. Az eddig előállított antiszérumok nem kielégítő specifidtása az immunizáláshoz használt immunogén szerkezetével hozható összefüggésbe. Tehát szükség volt olyan új immunogén előállítására, amellyel spedfikusabb antiszérum termelhető. Az epesavak szteroid-származékok és így 1000-nél kisebb molekulasúlyúak, aminek következtében önmagukban alkalmatlanok immunválasz kiváltására, ezért általában fehérjékhez kapcsolják őket. A kutatók a primer epesavakra vonatkozó immunogén előállításánál az epesavak glicinoldalláncának szabad karboxil-csoportját használták fel a fehérjével, például 194.275 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
