194275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új epesav származékok előállítására
1 194.275 2 bovin (marha) szérumalbuminnal (a továbbiakban BSA) való peptidkötés létrehozásánál. Általános az a tapasztalat, hogy a Szteroidok meghatározására termelt antiszérumok legspedfikusabbak a szteroid-molekula azon részére, amely „legtávolabb” van a fehérje kapcsolódási helyétől, és legkevésbé spedfikusak azon részére, amelyhez a fehérjét hozzákötötték. Glikokólsav esetében a fehérjéhez való kapcsolás addig minden esetben a glicinoldalláncon keresztül történt, így várható volt, hogy az antiszérum nem tud különbséget tenni a kólsav güko- és tauro-konjugáltja között, sőt a 7ahidroxil-csoport gátolt sztérikus helyzete miatt a kenodeoxikólsawal és konjugáltjaival is keresztreakdók várhatók .Az irodalmi adatok is ezt bizonyítják (Clin. Chim. Acta 54, 81 (1974), Gastroenterology 65, 705 (1973). A találmány alapja az a felismerés, hogy a hapténként használt kólsav gliko-konjugáltjában a fehérjét nem a glidn-oldalláncon keresztül, hanem a tőle térben legtávolabb lévő 3-as helyzetű hidroxil-csoporton keresztül célszerű kapcsolni, mivel a 3ahidroxil-csa port az összes humánepesavban megtalálható, így az antiszérumnak erre a csoportra nem kell spedfikusnak lennie. A haptén 3ahidroxil-csoportja azonban közvetlenül nem alkalmas a fehérjével peptid-, vagyis savamid-kötés létrehozására, ezért a hidroxil-csoportot egy dikarbonsawal, célszerűen borostyánkősavval acileztük. Az így kapott hemiszukdnát szabad karboxil-csoportja már felhasználható volt peptidkötés kialakítására. Dikarbonsavként használhatunk malonsavat, glutáisavat vagy adipinsavat is. A primer epesavak azonban a 3a-hidroxil-csoporton kívül még egy vagy két (7aés 12a) hidroxil-csoportot is tartalmaznak, ezért különösen nehéz feladatnak bizonyul a 3o-hidroxil-csoport szelektív acüezése. A találmány alapja továbbá az a felismerés, hogy a találmány szerinti eljárás körülményei között a 7a- és 12a -hidroxil-csoportok érintetlenek maradnak és csak a 3ahidroxil-csoport acileződik. Ugyanis a 7a- és 12a hidroxil-csoportok acilezése esetén az antiszérum nem tud különbséget tenni az egyes epesavak között. Másrészt gSko-konjugált epesavakról lévén szó, biztosítani kellett a glicin karboxil-csoportjának védelmét, hogy a BSA-kötés a későbbiekben ne ezen a helyen menjen végbe. A glidn karboxil-csoportjának védelmét észterképzéssel oldottuk meg. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű - ahol R jelentése 1-4 szénatomszámú alkilcsoport és n jelentése 1,2, 3 vagy 4 - új glikokólsav-származékok előállítására, amely abban áll, hogy egy (II) általános képletű — ahol R jelentése a fenti - glikokólsav-észtert egy (III) általános képletű - ahol n jelentése a fenti — dikarbonsav adlezésre alkalmas származékával acilezünk. Az eljárás előnyös kiviteli módja szerint az adlezést apoláris oldószerben, célszerűen absz. acetonitrilben, szobahőmérsékleten, keverés közben, 3 napon át végezzük és adlezőszerként borostyánkősavanhidridet alkalmazunk. Ilyen módon példaként előállítottuk a 3a(3-karboxi-propionil)-glikokólsav-metilésztert, amely maga is új vegyület és szerkezetét NMR- és IR- spektroszkópiával igazoltuk. A spektroszkópiai adatok igazolták, hogy a találmány szerinti eljárás-körülményei között a glikokólsav további hidroxil-csoportjai (7a és 12a) nem acilezödtek. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított (I) általános képletű új glikokólsav-származékok hatásosak és elsősorban felhasználhatók hapténként új immunogén előállításához. A haptént Erlanger és mtsai (J. Biol. Chem. 228, 713 (1957) módszere szerint kapcsoltuk a fehérjéhez, előnyösen marha-szérum-albuminhoz. Az így nyert új immunogénnel nyulakat immunizáltunk. Az immunizálást az ira dalomból ismert módon (Gastroenterology 65, 705 (1973) hajtottuk végre. Az immunizálás végén nyert antiszérum specifikusságát keresztreakdókkal jellemeztük. A találmány szerint előállított hapténnel nyert antiszérum glikokólsavra gyakorlatilag mona specifikus. A találmány szerinti eljárás — az oltalmi kör korlátozása nélkül - az alábbi példán szemléltetjük: 3a(3-karboxi-propionil) -glikokólsav-me til-észter: N-/3a(3-karboxi-propionil) -7a, 12adihidroxi-24-oxo -kolán-24-il/-glicil-metil-észter /a (I) képletben R = CH3 és n = 2/ 100 mg (0,21 nM) glikokólsav-metil-észtert 40 ml absz. acetonitrilben oldottunk, majd 28 mg (0,28 mM) borostyánkősavanhidridet adtunk hozzá és szobahőmérsékleten 3 napig kevertettük az elegyet. 20 ml absz. etanol hozzáadása után még két órán át kevertettük szobahőmérsékleten a reakdóelegyet, majd az oldatot 10 ml-re betöményítettük. Ezután 50 ml absz éterrel a 3a(3-karboxi-propionil)-g)ikokólsav-metilésztert kicsaptuk. A szilárd anyagot kiszűrtük, majd újra feloldottuk 10 ml absz. etanolban és 50 ml absz. éterrel kicsaptuk az anyagot. Ezt a műveletet még kétszer megismételtük, míg a kicsapott anyag kis részlete lH—MMR vizsgálat alapján borostyánkősavanhidrid-mentes lett. A termék fehér amorf por. Hozam: 101 mg (83%). IR (KBr): 3200-2700 széles ( -OH), 1730 ( CO észter), 1705 ( C= O sav), 1660 cm-1 ( C=0 amid) *H-MMR (CDCI3): 0,68 (3H, s, 19-CH3), 0,90 (3H, s, I8-CH3), 1,05 (3H, d, 2I-CH3), 2,63 (4H, s, -OOC-CH2-CH2-COO-), 3,71 (3H, s, -COOCH3) 3,80 (1H, m, 7-H), 4,00 (2H, d, N-CH2-COO-), 4,05 (1H, s, 12—rí), 4,58 (1H, sz, 3-H), 6,93 (1H, t, NH) ppm, A kiindulási glikokólsav-metil-észter, azaz az N-(3a 7a, 12atrihidroxí-24-oxakolán-24-il)-glidn -metilésztert /(II) képlet az alábbi módon állíthatjuk elő: 100 mg (0,22 mM) glikokólsavat 5 ml metanol-víz 9:1 arányú elegyében oldottunk. Teljes oldódás után kb. 1 ml diazometán 10%-os éteres oldatát adagoltuk hozzá mindaddig, míg a pezsgés megszűnt és az oldat enyhén sárgás színű maradt. Ezután a reakdóelegyet 3 órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd vákuumban szárazra pároltuk. 102 mg (99%) fehér amorf port kaptunk. IR (KBr): 3500-3200 ( -OH), 1740 ( C=0 észter), 1660 cm-1 ( A]= V'l) IR (KBr): 3500-3200 ( -OH),1740( C=0 észter), 1660 cm-1 ( C=0 amid) ‘H-MMR (CDC13), 3,71 « ppm, s, 3H észter (-COOCH3). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás (I) általános képletű - ahol R jelentése 1-4 'szénatomszámú alkilcsoport és n jelentése 1,2, 3 vagy 4 - új glikokólsav-származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képle-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
