194228. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, 11-helyzetben szubsztituált 5,11-dihidro-6h-pirido (2,3-b) (1 4)benzo-diazepin-6-onok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 228 2 ' Ezeknek a módszereknek az volt a céljuk, hogy az antimuscarin hatás szelektivitását bizonyítsa. Az alábbi vegyületeknek: A = 5,11-dili idr o-l l-[l-oxo-6-(l-piperidinil)-4-hexinil]-6H-pirido[2,3-b][ 1,4]benzodiazepin-6-on és B = 5,11-dihidro-l l-[l-oxo-6-(hexahidro-lH-azepin-l-il)-4-hexanil]-6H-pirido[2,3-b][l,4]benzodiazepin-6-on a következőkben felsorolt hatását vizsgáltuk: l..Tachycardiás hatás ébren lévő kutyán 2. Oxotremorinnal stimulált nyáladzás gátlása patkányon 3. Mydriaticus hatás patkányon 1. A szívverés szaporaságát fokozó hatás ébren lévő kutyákon A hatóanyagokat intravénás injekcióval adtuk be, és a szívverés frekvenciáját tachygráffal mértük. Bizonyos kontroll időtartam után a vegyület egyre növekvő dózisát alkalmaztuk, hogy a szívverés frekvenciáját megnöveljük. Mindig azután injekcióztuk be a következő dózist, miután az előző dózis hatása már nem volt észlelhető. A hatóanyagnak ezt a dózisát (ED5O0, ami a szívverés frekvenciáját 50 szívverés/perc értékkel növelte, grafikusan határoztuk meg. Minden egyes hatóanyagot 3-5 kutyán vizsgáltuk meg. 2. Nyáladzásgátlás patkányokon Kezelési csoportként 120—150 g testsúlyú nőstény albino patkányt (Cri: COBS-CD/SD/BR törzs) használtunk, amelyek ivóvízhez juthattak, de a kísérlet megkezdése előtt 24 órával nem kaptak táplálékot. Ahhoz, hogy az előkísérletekben az Oxotremorin muscarin hatását minden egyes vizsgált szimptómára megállapítsuk, minden egyes szimptómánál legalább három dózissal felrajzoltuk a dózis-hatás görbét. Az antimuscarin hatóanyagok vizsgálatánál olyan Oxotremorin dózist választottunk, amely az előkísérletekben az állatok 90—100 százalékánál a befolyásolandó szimptómát kiváltotta. Nyálelválasztás: 0,083 mg/kg i. v. Minden egyes antimuscarin hatású vegyületet azonos dózisban, intravénásán adtunk, az Oxotremorin beadása előtt 15 perccel. A kontrollcsoportok e vizsgálandó vegyület helyett a megfelelő mennyiségű oldószert vagy szuszpenziós közeget kapták. Közvetlenül az Oxotremorin beadás után az állatokat üvegketrecben negyed óra hosszat figyeltük. Az Oxotremorin által indulált nyálelválasztás befolyásolásának vizsgálatát vakon végeztük el, azaz a kísérletet végző személy nem tudta, hogy az állatok hogyan voltak előkezelve. Az eredményeket az Oxotremorin-effektus százalékos gátlásaként (a megfelelő szimptóma nélküli állatok százaléka) értékeltük ki. Az ED50 értékeket Lichtfield és Wilcoxon módszerével értékeltük ki (J. Pharmacol. Exp. Ther. 96, 99/1949)). 3. Mydriaticus hatás patkányokon A mydriasist a vizsgálandó vegyület beinjekciózása után az állatok megnövekedett pupillaszélességének mérésével határoztuk meg. A pupillaszélesség mérése mikroszkóppal történt. A méréseket a vizsgálandó vegyületek különböző dózisainak beinjekciózása előtt, valamint 15, 45 és 75 perccel utána végeztük el. Az eredményeket ED2oO értékekként adtuk meg. Ez azt a dózist jelenti, amelynél a pupillaátmérő két5 10 15 20 25 30 35 szer akkora lesz, mint az eredeti érték. A maximális hatást az intravénás injekció után 15-45 perc múlva lehetett észlelni. B. A muscarin-receptorokhoz való kötődés vizsgálata: Az ICS o érték meghatározása Szervdonorként 180-220 g súlyú, hím Sprague- Dawley patkányok szolgáltak. A szív, a gyomor és a nagyagykéreg kivétele után minden további műveletet jéghideg Hepes-pufferban (pH = 7,4, 100 ml mólos nátrium-klorid oldat és 10 ml mólos magnézium- klorid oldat) hajtottunk végre. A teljes szívet ollóval felaprítottuk. Végül minden szervet Potterben homogenizáltunk. A kötődési vizsgálatokhoz a szervhomogenizátumokat a következő arányban hígítottuk: Teljes szív 1 : 250 Nagy agykéreg 1 -.3000 A szervhomogenizátumok inkubációja Eppendorf-centrifugacsövecskékben történt, 30°C-on úgy hogy a radioligandumot egy meghatározott koncentrációban, a nem radioaktív vizsgálandó vegyületeket pedig koncentrációsorozatban alkalmaztuk. Az inkubáció időtartama 45 perc volt. Radioligandumként 0,3 jumól 3 H-N-metil-szkopolamin fH-NMS) szolgált. Az inkubáció befejeződése után 14 000 g gyorsulással centrifugáltuk a mintát, és a radioaktivitást pelletben határoztuk meg. Ez a radioaktivitás a 3H-NMS specifikus és nem-specifikus kötődésének az összegét reprezentálja. A nem-specifikus kötődés hányadát úgy definiáltuk, mint azt a radioaktivitást, ami 1 jumól Chinuclidinylbenzilat jelenlétében megkötődött. Mindig négy párhuzamos meghatározást végeztünk. A nem radioaktív vizsgálandó vegyületek ICS0 értékét grafikusan határoztuk meg. Ez a vizsgálandó vegyületnek azt a koncentrációját reprezentálja, amelynél 50%-kal csökkent a 3H-NMS-nek a muscarin receptorokhoz való specifikus kötődése a különböző szervekben. 40 45 50 Eredmények I. táblázat Hatóanyag A A B Tachycardia Nyáladzásgátlás (kutyán) (patkányon) ED50 ED50 Mg/kg i. v. Mg/kg i. v. 44 2048 28 1136 Mydriasis (patkányon) E^200 Mg/kg 1. v.-3000 2189 II. táblázat Hatóanyag A receptorhoz való kötődés vizsgálata IC50(nM) _____________Nagy agykéreg_________Szív 1200 120 B 220 30 Az I. táblázat farmakológiai adataiból látható, hogy a nevezett vegyületek a szívverés szaporaságát 55 már olyan dózisban is emelik, amelynél nem figyelhető meg mydriasis, illetve amelynél a nyáladzás nem gátolt. A II. táblázat adatai azt mutatják, hogy az (I) általános képletű, új vegyületek a különböző szövetek muscarin receptoraihoz eltérően kötődnek. 60 Ez következik abból, hogy a nagyagykéregből nyert 5
