194225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11-oxo-11H-pirido [2,1-b]kinazolin-karbonsav-származékok és e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 225 2 PGHj-t extraháljuk és vékonyrétegkromatográfiás elemzésnek vetjük alá. A termékekké alakult i4C-PGHa mennyiségét vékonyrétegkromatográfiás úton határozzuk meg. A termékekké alakult 14 C-PGHj mennyisége szolgál a TXAj szlntáz aktivitás mértéke gyanánt. Az inhibitorokat kezdetben 100 pmól végső koncentrációban használjuk a teszthez. e) Acetil-kolin által előidézett összehúzódás antagonizálása tengerimalac ileumon Az antikolinerg aktivitást 37°C-os oxigénezett Tyrode oldatot tartalmazó fürdőben felfüggesztett tengerimalac ileum fregmensen határozzuk meg. Az ileumot 4 perces időközökben 5,0 x 10~7 mól acetil-kolinnal kezeljük, a csúcs összehúzódás előidézéséhez elegendő ideig, majd friss Tyrode-oldattal mossuk. Miután a szövet acetil-kolinnal szemben mutatott reagálása stabilizálódott, az ileumot az acetil-kloridos újbóli kezelés előtt 1 perccel standard antikolinerg szerrel (atropin-szulfáttal) előkezeljük, majd az összehúzódást feljegyezzük és a szövetet Tyrodeoldattal mossuk. Az atropin-szulfátot az acetil-kolin reagálás maximális gátlásáig növekvő koncentrációban alkalmazzuk. Az atropin ICÍ0 értéke 1 x io'* mól. A teszt vegyületek IC5 0 értékeit ugyanezzel az eljárással határozzuk meg. f) Hisztamin által előidézett tengerimalac ileum összehúzódás antaginizálása Az antihisztamin aktivitást 37°C-os oxigénezett Tyrode-oldatban felfüggesztett tengerimalac ileum szegmenseken határozzuk meg. Az ileumot 4 perces időközökben lxlO"7 mól hisztaminnal kezeljük, a csúcs-összehúzódás eléréséhez elegendő ideig, majd friss Tyrode-oldattal mossuk. A szövetnek a hisztaminnal szemben mutatott reagálásának stabilizálódása után az ileumot a hisztaminnal való újbóli kezelés előtt egy perccel standard antihisztamin ágenssel (pirilamin-maleáttal) előkezeljük, az összehúzódást feljegyezzük és a szövetet Tyrode-oldattal mossuk. A pirilamin-maleátot a hisztamin reagálás maximális gátlásának eléréséig növekvő koncentrációban alkalmazzuk. A pirilamin-maleát ICJ0 értéke ennél a tesztnél 1x10"’ mól. A teszt-vegyületek ICS0 értékeit ugyanezzel a módszerrel határozzuk meg. g) Vérlemezke aktiváló faktor (PAF) és hisztamin által előidézett hörgő-összehúzódás antagonízálása tengerimalacon 300—450 g súlyú, spontán lélegző hím tengerimalacokat az agonista beadása előtt a teszt-vegyülettel vagy a kontroll hordozóanyaggal orálisan kezelünk. Az állatokat uretánnal (2 mg/kg, i. p.) anesztetizáljuk és a nyakérbe és a légcsőbe kannült illesztünk. A teszt-vegyület beadása után 2 órával az állatokat szukcinil-kloriddal (1,2 mg/kg, i. v.) megbénítjuk és mesterségesen lélegeztetjük (40 légzés/perc, 2,5 ml légzési térfogat). Az állatoknak propranololt adunk be (0,1 mg/kg, i. v.), majd 5 perc múlva az állatok összehúzódást előidéző dózisban vérlemezke aktiváló faktort (10 Mg/kg, i- v.) vagy hisztamin-dihidrokloridot (20 Mg/kg, i. v.) kapnak. Az előzetes és csúcs ventillációs nyomás közötti különbséget (cm HjO) három kontroll és öt kezelt állat átlagában adjulc meg. A százalékos gátlást az alábbi képlet segítségével számítjuk ki: Kontroll - Teszt-ve^yillettel kezelt x jqq h) Kálium-klorid által előidézett ileum összehúzódás antagonízálása tengerimalacon 200-250 g súlyú tengerimalacokból elíáyolított 1-1.5 cm-es Ueum szegmenst 10 ml Tyrode-oldatot (10*® mól atropin-szulfát és 10‘* mól pirilamin-maleát is jelen van) tartalmazó szerves fürdőben felfüggesztünk. A fürdőt 37°C-on tartjuk és 95% oxigén és 5% szén-dioxid elegyével levegőztetjük. A kálium-klorid 10-30 millimól koncentrációban előidézi az üeum izometrikus összehúzódását. Az összehúzódás két fázisból áll,' a kezdeti gyors összehúzódást (fázikus szakasz) a kevésbé intenzív, azonban hosszantartó összehúzódás (tçnikus szakasz) követi. Az ileumot a kálium-kloridos kezelés előtt 3 perccel változó koncentrációjú teszt-vegyülettel inkubáljuk. A tesztvegyületnek a kálium-klorid által kiváltott összehúzódás fázikus és t^nikus szakaszai 50%-os gátlását előidéző dózisait meghatározzuk; ez az ICj0 érték. i) Passzívan érzékennyé tett patkányok kután anafllaxisának gátlása 1) Az antiszérum elkészítése IgE- tartalmú patkány antiszérumot (reagens antiszérum) a következő eljárással készítünk: normális hím Sprague-Dawley patkányokat (testsúly 150-200 g) 0,5 ml Bordetella pertussis vaccina (20 ou/ml; 100 Mg tojásalbumint tartalmaz) intraperitoneális befecskendezésével immunizálunk. A 16. napon Nippostrongylus brasiliensist (3000 lárva/ 0,1 ml) fecskendezünk be szubkután úton és a 21. napon 10 Mg tojásalbumint adagolunk be intraperitoneáüsan, 0,5 ml n nátrium-klorid-oldatban. A 20. napon szívpungálással vért gyűjtünk és a szérumot centrifugálással elválasztjuk és egy éjjelen át 5°C-os hűtőszekrényben tartjuk. A szérum antitest-aktivitását 24 órás érzékenyítő időszak eltelte után (lásd az alábbiakban) a passzív kutáns anafilaxiás teszttel meghatározzuk. A PCA teszthez csak azokat a szérumokat használjuk fel, amelyek normál nátrium-klorid-oldattal készített 1 : 50 higítású szérum (0,05 ml) intradermális befecskendezés után 3 mm vagy ennél nagyobb átlagos pörsenés-átmérőt adnak. Ezeket a szérumokat összegyűjtjük, aliquot részekre osztjuk és felhasználásig fagyasztva tároljuk. Az anti-szérum reagens tulajdonságait az jelzi, hogy 56°C-on 4 órán át történő melegítés után inaktiválódás lép fel. A regens hatás további igazolása céljából a szérumot patkány anti-IGE-vel, anti-IgG-vel, jnti-IgA-val és anti IgM-el in vitro inkubáljuk. A mintákat 1 órán át 20'X-on, majd 16 órán keresztül 4°C-on történő inkubálás után centrifugáljuk és a felületelhelyező folyadékok aktivitását a PCA tesztben meghatározzuk. Csupán az anti-lgE felhasználásával inkubált frakciók voltak inaktívak. 2) Az állaton végzett eljárás A passzív kutáns anafilaxis tesztet (PCA) 190— 220 g súlyú Sprague-Dawley patkányokon, a Hőssé J. és Blair A. M. J. N. által leírt eljáráshoz [Immunology 16, 749 (1969)] hasonló módon határozzuk meg. Nátrium-klorid-oldattal 1 : 512 arányban hígított szérumot készítünk és e titer szérum két aluquot részletét (0,05 ml) intradermálisan az állatok borotvált hátbőrébe fecskendezzük (ez az antitest-mennyiség kb. 7 mm-es átlagos pörsenés-átmérőt eredmé-1 nyez). 24 órás érzékenyítési időszak után minden állat farokvénáján keresztül 8 mg tojásalbumint és s 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
