193973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4'-deklórrebekkamicin és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
-lombikba levő 100 ml steril táptalajba. Ez utóbbi táptalaj 30 g glükózt, 10 g szójalisztet, 10 g gyapotmagcsíra-lisztet és 3 g kalcium-karbonátot tartalmaz, ezeket az összetevőket desztillált vízzel 1 1 térfogatra egészítjük ki. Ezt a vegetatív tenyészetet 48 órán át 27°C-on, egy Gyrotory tálcás rázógépen (Model G53), New Brunswick Scientific Co., Inc.) rázatjuk. A rázógép percenként 210-szer fordul, és egy 5,1 cm átmérőjű kört ír le. A vegetatív tenyészet 4 ml térfogatú részletét átvisszük egy 500 ml Erlenmeyer-lombikban levő 100 ml steril termelő táptalajba, a termelő táptalaj 60 g kukorica-keményítőt, 10 g glükózt, 15 g lenmagolajat, 5,0 g autolizált élesztőt, 1,0 g vas(II)szulfát-heptahidrátot, 1,0 g ammónium-dihidrogén-foszfátot, 1,0 g ammónium-szulfátot és 10 g kalcium-karbonátot tartalmaz, ezeket az öszszetevőket desztillált vízzel 1 1 térfogatra egészítjük ki. A termelő tenyészetet egy rázógépen, például a vegetatív tenyészet előállítása során használt típusú rázógépen tartjuk, 27°C hőmérsékleten. A rázatás sebessége: 250 fordulat/perc. A fermentálást 168 órán át végezzük. Elkülönítés Az előző pontban leírt módon kapott tenyészetet diatomaföld mint szűrési segédanyag segítségével megszűrjük (a szűrési segédanyagot egyrészt belekeverjük a tenyészetbe, másrészt a szűrőre is rétegezzük). A szürletet elöntjük, és a kiszűrt anyagot 30— 60 percen át tetrahidrofuránnal kivonatoljuk, mégpedig a tenyészet eredeti térfogatára számított 0,1—0,2 térfogatrész oldószert használunk (a tetrahidrofurán konzerválószerként előnyösen 0,025% butilezett hidroxi-toluolokat tartalmaz). A tetrahidrofurános kivonatot megszűrjük, és az oldatlan részeket kidobjuk. A szűrletet csökkentett nyomáson olyan mértékben töményítjük be, hogy a tetrahidrofuránnak majdnem a teljes menynyiséget eltávolítjuk. Ezután a betöményített oldathoz szűrési segédanyagot adunk, és a szuszpenziót olyan szűrőn szűrjük át, amelyre előzőleg ugyancsak szűrési segédanyagot rétegezünk. Ezután 4 órán át vagy hosszabb ideig levegőt szívatunk keresztül a kiszűrt anyagon, hogy a lehető legnagyobb mértékben megszárítsuk. Ezután a fent leírt módon kapott, kiszűrt anyagot körülbelül félórán át annyi tetrahidrofuránnal kivonatoljuk, amellyel a kiszűrt anyag jól felszuszpendálható. Utána az oldatlan részeket kiszűrjük és eldobjuk. A szűrletet normál nyomáson forralva betöményítjiik. Ennek során forró metanolt adunk az oldathoz, amikor annak térfogata már kicsi lesz. Miután az oldatból sárgaszínü, szilárd anyag kezd kiválni, az elegyet enyhén forraljuk mindaddig, míg az elegyben levő szilárd anyag ezt meg nem nehezíti. Ekkor hagyjuk az elegyet lehűlni, és 5—8°C hőmérsékletre hütjük. A kivált szilárd anyagot kiszűr21 12 jük, hideg metanollal mossuk és megszárítjuk. Az alábbi elválasztási műveletben ezt — a 4’-deklór-rebekkamicint tartalmazó — terméket használjuk. Elválasztás és tisztítás 336,3 g, az előző pontban leírt módon kapott szilárd nyersterméket felszuszpendálunk, és részben feloldunk 2,5 1 olyan oldószerelegyben, amely két rész kloroformból és egy rész metanolból áll. Az elegyet beleöntjük egy 6 1-es gömblombikba, és hozzáadunk körülbelül 1 kg szűrési segédanyagot (Dicalite). Utána az elegyet körülbelül 1,5 1 Skellysolve B-vel hígítjuk, majd az így kapott szuszpenzióról az oldószert csökkentett nyomsáon, egy forgó rendszerű desztilláló készüléken ledesztilláljuk. A porszerű maradékot felszuszpendáljuk 6 1 Skellysolve B-ben, és beletöltjük egy 12 cm külső átmérőjű és 90 cm hosszú flash-krornatográfiás oszlopba. Az oszlop töltetét 4 -104 Pa nitrogén-nyomás alatt készítjük el. A megtöltött oszlopot nyomás alatt eluáljuk, az alábbi oldószerekkel: 9 1 Skellysolve B (6 1 oldószer az oszlop töltéséhez + 3 liter friss oldószer); 13 1 toluol; 12 I diklór-metán; 12 ! etil-acetát; 18 1 tetrahidrofurán, és 7 liter metanol. A toluolos oldatról az oldószert csökkentett nyomáson, egy forgó rendszerű desztilláló készüléken ledesztilláljuk, ily módon 5,15 g szilárd maradékot kapunk (A-jelű maradék). Egy 2,67 cm belső átmérőjű és 75 cm hosszú Glenco Series 3500 Universal LC jelzésű oszlopot megtöltünk 80 g Woelm-féle (0,063—0,200 mm szemcseméretű) szilikagéllel, oldószerként kloroformot használunk. Az A-jelű maradékot feloldjuk 40 ml kloroformban, és az oldatot közvetlenül az oszlopra szívatjuk. Az oszlopot először 500 ml kloroformmal mossuk, majd lineáris gradiens elúciót végzünk kloroformmal és metanol és kloroform 5:95 arányú elegyével. 20 darab, egyenként 200 ml térfogatú frakciót szedünk. A 13—16. frakciók tartalma közel tisztának tekinthető. A frakciókat egyesítjük, és az oldószert ledesztilláljuk. Ily módon 663 mg anyagot kapunk (B-jelű maradék). A 2,67 cm belső átmérőjű és 75 cm hosszú Glenco-oszlopot megtöltjük Baker Bonded Phase Octadecyl (C-18) szilikagéllel, oldószerként metanolt használunk. Az oszlopot a töltet térfogatára számított 2,5 térfogatú oldószereleggyel hozzuk egyensúlyba, az oldószerelegy acetonitril, metanol és 0,1 mólos ammónium-acetát-oldat 3:3:4 arányú elegye. A B-jelű maradékot feloldjuk 3 ml dimetil-szulfoxidban, az oldatot beleszívatjuk a minta bevitelére szolgáló csőbe, és az eluens segítségével az oszlopra szívatjuk. Ezután az oszlopot úgy eluáljuk, hogy az oszlopból kifolyó folyadékot 280 nm hullámhossznál folyamatosan vizsgáljuk. Az első 2 1 térfogatú előfrakció ktán 40 darab, egyenként 50 ml térfogatú frakciót szedünk. Az UV-kromatogramm alapján a 9—32. frakciókat 22 193973 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
