193902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aminosavak előállítására transzaminálás útján
(NH4)2S04 750 mg/liter Na3citrát.2H20 1,0 g/liter Nyomelem-oldat 3 ml/liter A glükózt szükség szerint szivattyúzzuk a keverékhez. A növesztést 37°C hőmérsékleten, levegőztetés mellett, 300 fordulat/perc sebességgel kevertetve, és a pH-t ammónium-hidroxiddal títrálva 6,9-en tartva végezzük. A sejteket 4000 fordulat/perccel centrifugálva kinyerjük és —10°C hőmérsékleten fagyasztjuk, amíg szükséges. Az aromás sav transzamináz tisztítása Minden lépést 4°C hőmérsékleten hajtunk végre. A centrifugálást Sorvall RC2B centrifugában végezzük. 1. ) E. coli K—12 sejteket (80 g nedves súly) 200 ml -vizes puffer-oldatban (pH 7,0) újra szuszpendálunk, a vizes puffer-oldat 200 mmól/liter kálium-foszfátot, 1 mmól/liter etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) din átrium-sót, 1 mmól/liter béta-merkapto-etanolt, 1 mmól/liter piridoxál-foszfátot, és 0,02% (tömeg/térfogat) nátrium-azidot tartalmaz. A sejteket ultrahanggal kezeljük, Heat Systems Ultrahang sejtoncsoló berendezést használva 4 egy perces sorozattal, a teljesítményt 9-re állítva be. A sejttörmeléket 12 000 fordulat/perccel 20 percen át végzett centrifugálással elkülönítjük. 2. ) A nyers extraktumot (az 1. lépésből származó felülúszót) 40%-os sztreptomicin-szulíát-oldat (amely az 1. lépés szerinti pufferral készült) megfelelő mennyiségének hozzáadásával sztreptomicin-szulfátra 1,25 súly/térfogat %-ossá tesszük. A keveréket 20 percen át lassan kevertetjük, majd 12 000 fordulat/perccel 20 percet át centrifugáljuk. A csapadékot eldobjuk. 3. ) A 2. lépés felülúszójából származó fehérjét ammónium-szulfát hozzáadásával frakcionáljuk. Kristályos ammóniumszulfátot adunk be keverés közben, amíg a 40%-os telítettségnek megfelelő koncentrációt elérjük, és a kicsapódott fehérjét kicentrifugáljuk és eldobjuk. További ammónium-szulfátot adunk be keverés közben, amíg a 70%-os telítettségnek megfelelő koncentrációt elérjük, és a kicsapódott fehérjét centrifugáljuk, összegyűjtjük, és újra feloldjuk minimális mennyiségű, következő összetételű, pH 6,5 értékű pufferban: 0,03 mól/liter nátrium-foszfát, 1 mmól/liter etilén-diamin-tetraecetsav dinátrium-só, 1 'mmól béta-merkapto-etanol, és 0,02% (súly/térfogat) nátrium-azid. Az oldatot 2 liter hasonló összetételű pufferral szemben dializáljuk (18 óra, kétszeri puffercsere). 4. ) DEAE cellulóz oszlopot (Whatman DE—52, 1,6X30 cm) kiegyensúlyozunk a 3. lépés szerinti pufferral. A mintát az oszlopra tápláljuk, és addig mossuk, amíg több fehérje az elfolyó folyadékban nem mérhető az OD280 módszerrel mérve (<0,02).0—0,5 mól/literes lineáris NaCl 7 gradienst hozunk létre, 250 ml teljes térfogattal, áramlási sebesség = 4 ml/10 perc/ /frakció. A transzamináz-aktivitás a 0,09 és 0,2 mól/liter NaCl között eluálódik, ezt öszszegyűjtjük és 2X2 liter 6,5 pH-jú pufferral szemben dializáljuk, a puffer összetétele: 0,03 mól/liter nátrium-foszfát, 1 mmól/liter etilén-diamin-tetraacetát nátrium-sóv 1 mmól/ /liter béta-merkapto-etanol és 0,02 mmól/ /liter piridoxál-foszfát. 5. ) A transzamináz oldatot egy 2,6X X30 cm-es hidroxiapatit oszlopra tápláljuk, és kiegyensúlyozzuk a 4. lépés szerinti dtalízis-pufferral. A transzamináz aktivitást az oszlop nem tartja vissza, és kb. 4 ml-re koncentrálódik Amicon ultraszűrő berendezést használva YM 30 membránnal. 6. ) Az előző lépésből származó koncentrált transzaminázt Sephacryl 5—200 oszlopra tápláljuk, az oszlop mérete 2,6X90 cm, a transzaminázt 0,05 mól/liter Tris-t (pH 8,0), 0,02 mmól/liter piridoxál-foszfátot, 1 mmól/liter EDTA-t és 1 mmól/liter béta-merkapto-etanolt tartalmazó oldatban visszük fel. Az eluálás ugyanezzel a pufferral a transzamináz aktivitás egy csíkját adja, amely közvetlenül az üres térfogat után eluálódik. Ezt az anyagot 4°C hőmérsékleten tároljuk, ez legalább 4 hónapig stabil. Az oxálecetsav dekarboxilázt Micrococcus luteusból, Pseudomonas putidából vagy hasonlókból lehet előállítani, hasonló módszerekkel, amint ez a szakterületen jól ismert. 2. példa L-fenilalanin előállítása 0,8 ml 7,0 pH-jú oldathoz, amely 50 mmól/ /liter káliumfoszfát puffert, 12,5 mmól/liter fenil-piruvátot, 25 mmól/liter L-aszparaginsavat, 1,25 mmól/liter mangán-szulfátot, 5 mmól/liter piridoxál-foszfátot és 1,5 nemzetközi egység oxálecetsav dekarboxilázt tartalmaz, 0,2 ml 7,0 pH-jú, 0,3 nemzetközi egység (IU) transzaminázt tartalmazó oldatot adunk. Mind közvetlenül ez után, mind 12 órával később 22°C hőmérsékleten történő inkubálás után a reakciókeveréket piruváttartalomra meghatározzuk. A konverzió szintjét az átalakult fenil-piruvát mennyisége alapján 98,5%-nak kalkuláljuk. A reakciókeverek aminosav-analízise csak két csúcsot mutat: az L-fenilalaninét és a nem reagált L-aszparaginsavét. Más aminosav nem mutatható ki. 3. példa A transzamináz és az oxálecetsav dekarboxiláz immobilizálása. 2,0 ml vizes 50 mmól/literes kálium-foszfát oldatot (pH 8,0), amely 1,5 egység transzaminázt és 5,4 egység Micrococcus luteusból izolált oxálecetsav dekarboxilázt tartalmaz, adunk 5,0 ml DEAE cellulóz gélhez (Whatman DE—52), amelyet előzőleg 50 mmólos, pH 8-as foszfát pufferral kiegyensúlyoztunk. Enyhe 5 perces keverés 8 5 193902 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
