193902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aminosavak előállítására transzaminálás útján
193902 után mind a transzamináz, mind az oxálecetsav dekarboxiláz meghatározása azt jelzi, hogy az enzimek a DEAE cellulózon adszorbeálódtak, és a maradék oldatot a gélről dekantáljuk. 4. példa Más módszer L-fenilaianin előállítására. A 3. példa szerinti immobilizált enzim készítményhez a következő oldatokat adjuk: 2,0 ml 50 mmól/iiteres kálium-foszfát (pH 8,0); 0,5 ml 50 mmól/literes fenil-piruvát; 0,5 ml 50 mmól/literes L-aszpartát, és 1,0 ml 10 mmól/literes mangán-szulfát. 12 órás inkubálás után a meghatározás a fenil-piruvát fenil-alaninná való konverziójának szintjére 96%-ot mutat. Ezt az L-fenilalanin detektálásával igazolták papír-kromatográfiával, a következő eluálószolvenst alkalmazva: n-butanol: aceton : ammónium-hidroxid : : víz 5:3:1:1 A reakciókeverék aminosav-tartalma Dionex aminosavanalizátorral meghatározva csak két kimutatható csúcsot mutat, ezek L-fenilalaninnak és L-aszparaginsavnak felelnek meg. Az L-fenilalanint BioRad AG 50 1X8 20— 50 mesh szemcseméretű kevertágyas ioncserélő gyantán tisztítjuk. A nyers reakciókeveréket pH 8 értéken egy előzőleg azonos pH-ra kiegyensúlyozott gyanta-oszlopon engedjük át, és az oszlopot előbb 2 oszloptérfogat vízzel, majd 50 mmól/literes 8,0 pH-jú kálium-foszfát pufferral eluáljuk. A fenilalanint az eluátumból liofilezéssel, vagy savanyítással és kristályosítással nyerhetjük ki. 5. példa Más módszer L-fenilalanin előállítására 19 ml 50 mmól/literes kálium-foszfát oldatot, amely 0,5 mmól/liter piridoxál-foszfátot, 1 mmól/liter MnS04-et, 5 nemzetközi egység Micrococcus luteusból izolált oxálecetsav dekarboxilázt, 50 mmól/liter fenil-piruvátot, és 65 mmól/liter aszparaginsavat tartalmaz, 12 órán át 24°C hőmérsékleten inkubálunk. Amikor ez az idő elérkezett, a fenil-piruvát mennyiségét kvantitatíven meghatározzuk olyan módon, hogy 50 mikroliteres alikvotot kiveszünk a keverékből, 1,0 ml 2,5%-os NaOH oldattal hígítjuk, és az optikai sűrűséget 320 nm-nél leolvassuk; az eredmény azt jelzi, hogy az összes fenil-piruvát átalakult L-fenilalaninná. A papír-kromatográfiás vizsgálat — futtatóként butanohacetomammónium-hidroxid:víz 5:3:1:1 -et használva, majd ezt követően a festést acetonban oldott ninhidrinnel végezve — azt mutatja, hogy csak két ninhidrin-pozitív folt van jelen, amelyek az el nem reagált L-aszparaginsavnak és az L-fenilalaninnak felelnek meg. 6. példa L-tirozin előállítása 50 mmól/literes kálium-foszfáttal pH 7,0 értéken pufferolt oldatot, amely 1 mmól/liter 6 9 MgS04-et, 10 mmól/liter p-hidroxi-fenil-píruvátot, 10 mmól/liter aszparaginsavat, 0. 1 mg/ml transzaminázt és 0,1 mg/ml Pseudomonas putida (ATTC 950)-bői izolált oxálecetsav dekarboxilázt tartalmaz, inkubálunk 24°C hőmérsékleten 1 órán át. Amikor ez az időpont elérkezett, a meghatározás azt jelzi, hogy p-hidroxi-fenilpiruvát nem maradt. A képződött L-tirozin mennyiségét kvantitatíven megmérve olyan módon, hogy egy alikvotot Dionex aminosav-analizátorba fecskendezünk, moláris alapon 99%-os kitermelést kapunk p-hidroxi-fenil-piruvátból. Az így előállított L-tirozint és piroszőlősavat hasonló módszerekkel tisztíthatjuk, mint amelyet a 4. példában a fenil-alaninhoz alkalmaztunk, de alkalmazhatunk más, a szakterületen jól ismert módszert is. 7. példa L-triptofán előállítása Egy olyan oldatot, amely 20 mmól/liter indol-3-piruvátot, 20 mmól/liter aszparaginsavat, 1,5 mmól/liter MgCl2-t, 0,3 mg/ml transzaminázt, 0,3 mg/ml oxálecetsav dekarboxilázt tartalmaz, és amely 5 mmól/liter tris-hidroxi-metilamino-metán . hidrokloriddal (Tris) pH 7,0-ra van puffer.olva, 2 órán át lassan kevertetünk. Amikor ez az idő elérkezett, a reakció teljessé válik. Az előállított 1. -triptofánt és piroszőlősavat a szakterületen jól ismert módszerekkel tisztíthatjuk. 8. példa L-leucin előállítása Egy olyan oldatot, amely 2,5 mmól/litcr MgCl2-t, 100 mmól/liter 2-oxo-4-metil-pentánsavat,. 100 mmól/liter L-aszparaginsavat, 1,0 mg/ml transzaminázt, 1,0 mg/ml oxálecetsav dekarboxilázt tartalmaz, és amelynek pH-ja NaOH-val 7,0-ra van beállítva, kevertetünk lassan 30DC hőmérsékleten 4 órán át. A keletkezett L-leucint és piroszőlősavat a szakterületen jól ismert módszerek bármelyikével tisztíthatjuk. 9. példa L-valin előállítása Egy olyan oldatot, amely 2,5 mmól/liter MgCI2-t, 100 mmól/liter 2-oxo-3-metil-butánsavat, 100 mmól/liter L-aszparaginsavat, 1.0 mg/ml transzaminázt 1,0 mg/ml oxálecetsav dekarboxilázt tartalmaz, és amelynek pH-ja NaOH-val 7,0-ra van beállítva, kevertetünk lassan 30°C hőmérsékleten 4 órán át. A keletkezett L-valint és piroszőlősavat a szakterületen jól ismert módszerek bármelyikével tisztíthatjuk. 10. példa L.-szerin előállítása Egy olyan oldatot, amely 2,5 mmól/liter MgCl2-t, 100 mmól/liter 3-hidroxi-piruvátot, 1.0 mg/ml transzaminázt, 1,0 mg/ml oxálecetsav dekarboxilázt tartalmaz, és amelynek pH-ja NaOH-val 7,0-ra van beállítva, kever-10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
