193870. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a digitális lanata primer glikozidjainak szekunder glikozidokká történő átalakítására
ve a víz tömegének arányát tág határok között változtathatjuk, előnyösen olyan arányt választunk, hogy a kapott szuszpenzió még jól kezelhető (elválasztható) és könnyen, pontosan adagolható legyen. Ilyen szuszpenzió 5-50 tömeg% csigát tartalmaz. Az így kapott szuszpenzió (homogenizátum) már önmagában is alkalmas enzimkatalizátorként, előnyös azonban, ha a szuszpenziót nagy fordulatszámmal (például 6.000-10.000^) 10-60 percig centrifugáljuk és csak a felüluszót (kivonatot) használjuk. Igen fontos, hogy a szuszpenziót, vagy a kivonatot megóvjuk az enzimek bomlásától, ezért vagy frissen kell felhasználni, vagy mélyhűtött állapotban tárolni. A tárolás ideje is a bomlás miatt limitált. A szuszpenzió, illetve a felülúszóként nyert kivonat fagyasztott állapotban maximálisan fél évig aktív. Ezért igen hatásos, ha a szuszpenziót, vagy előnyösen a kivonatot egy ismert módszerrel, valamely ismert berendezésben liofizáljuk és a liofizátumot hűvös helyen tároljuk. A liofilizátum legalább egy évig aktivitás csökkenés nélkül eltartható. Ez az idő azért elegendő, mert a következő esztendőben ismét friss csigát alkalmazhatunk. A Iiofilizátumbó! vízzel és megfelelő pufferrel (például Trisz-puffer, citrát-puffer, stb.) az enzimkatalizátor oldat könnyen elkészíthető. A találmányunk szerinti eljárásban primer glikozidként egyaránt alkalmazhatjuk a Digitalis lanata-ból egy ismert eljárással kinyert (pl. lanatozid-C, stb) vegyületeket, illetve primer glikozid forrásként magát a Digitalis lanata növényt, előnyösen annak levelét. A Digitalis lanata levele lehet frissen szedett, szikkasztott, egy ismert eljárással szárított, vagy mikrohullámú besugárzással kezelt Digitalis lanata fólium. [Szabadalmi Közlöny és Védjegyismertető (T/34 219; 1985. 01. 28.) Budapest, Magyarország]. A találmányunk szerinti eljárás egyik foganatosítási módja) szerint — amelynél a Digitalis lanata primer glikozidjából indulunk ki — első lépésben tömény kis szénatomszámú alkanolban, célszerűen metanolban mintegy 10-50 mg/ml koncentrációjú törzsoldatot készítünk, amelyet az átalakításhoz kisebb, mint 5 mg/kg végkoncentrációra hígítunk. A hígításhoz vizet és olyan puffer oldatot használunk, hogy az oldat pH-értéke 4-7 legyen, optimális (98%-nál nagyobb) kitermelés 5- -6 pH-érték mellett kapunk. Ehhez az oldathoz adjuk a Helix pomatia katalizátor készítmény vizes oldatát. Az enzim katalizátort előnyösen 20-30 t%-os oldat alakjában adagoljuk a reakcióelegyhez, oly módon, hogy mennyisége 10-50 mg csiga/mg primer glikozid legyen. Ezután a reakcióelegyet 25-45°C, célszerűen 32-39°C, előnyösen 33-37°C hőmérsékleten 20-120’—, előnyösen 30-60’-ig inkubáljuk. Az egy órás inkubálás eredményét a hőmérséklet függvényében az 1. ábra szemlélteti, amelyből kitűnik, hogy 37°C-on az átalakulás gyakorlatilag 100%-os. A 2. ábrán az 3 enzim katalizátor mennyiségének befolyását szemléltetjük 25°C-on mg csiga/0,5 mg primer glikozid léptékben. Az ábrából kitűnik, hogy kis mennyiségi! katalizátor alkalmazása esetén még átalakulatlan, vagy részben átalakult — acetil-, illetve dezacetil — primer glikozid is marad a reakció elegyben. Az optimális átalakulást 10-50 mg csigából készült enzimkatalizátor/0,5 mg primer glikozid eredményezi. A reakcióparaméterek összefüggésének vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy az átalakulás sebessége 1 óra után sem csökken. Ha tehát az optimális feltételek között 1 órás inkubálás után 50 mg-nyi primer glikozid 1 gnyi csigából előállított enzimkatalizátor hozzáadásával gyakorlatilag teljes mértékben szekunder glikoziddá alakul, hasonló mértékű átalakulás érhető el akkor is, ha csökkentjük a katalizátor mennyiségét, de megfelelően növeljük a reakcióidőt. A találmányunk szerinti eljárás egy másik foganatosítási módja szerint nem homogén oldatban dolgozunk, hanem heterogén közegben, azaz szuszpenzióban végezzük az átalakítást. Ebben az esetben a primer glikozido(ka)t mintegy 10 tf%-os vizes alkanolban, előnyösen metanolban vagy etanolban szuszpendáljuk, és a szuszpenzióhoz adagoljuk az enzimkatalizátor készítményt. Célszerűen á szuszpenzió 1-50 mg primer glikozidot/ml oldószer tartalmaz. Eljárhatunk azonban oly módon is, hogy első lépésben a rövid szénláncú alkanolban, előnyösen metanolban tömény glikozid oldatot készítünk, és ezt a tömény oldatot adagoljuk a Helix pomatia enzimkatalizátor készítményhez (a csiga homogenizátumához, illetve a kivonatához). Abban az esetben, ha híg alkanolos szuszpenzióban végezzük az átalakítást, a reakció sebességét a lanatozid-C oldódása szabja meg. A találmányunk szerinti eljárás egy további foganatosítási módja szerint a Digitalis növényt, előnyösen a levelét alkalmazzuk kiindulási anyagként. A levelet (fóliumot) súlyára számított, célszerűen 1-5 szőrös mennyiségű vízben szuszpendáljuk, majd igen finomra őröljük. A víz mennyiségét az szabja meg, hogy friss (nedves) vagy szárított levelet kívánunk feldolgozni. Friss levél esetén kevesebb, szárított fóliumhoz több vízre van szükségünk ahhoz, hogy a finom szuszpenzió még jól kezelhető (keverhető) —, de feleslegesen híg se legyen. Az alkalmazott enzimkatalizátor mennyiségét a növény primer glikozid tartalma szerint választjuk meg, előnyösen azonos arányt alkalmazunk, mint a primer glikozidok átalakításánál. A reakció egyéb paraméterei (hőfok, idő, stb.) is az oldatban végzett reakcióval azonosak. A találmányunk tehát eljárás Digitalis lanata primer glikozidj (á/ai)nak szekunder glikozid (d/okk) á történő átalakítására Helix pomatia (éticsiga) enzimjeinek alkalmazása útján, azzal jellemezve, hogy 4 193870 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
