193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
193866 mazik, és amely a fentiekben ismertetett rezisztens markereken kívül egy, a Hind III enzimre érzékeny bázis-sorrendet is tartalmaz. A plazmid kiválasztásához hasonlóan a megfelelő gazdabaktérium kiválasztásakor is sok mikroorganizmus között választhatunk, azonban közbiztonsági okokból a felhasználható mikroorganizmusok száma igen kevés. A National Institute of Health engedélyét megkapta egy kitenyésztett E.coli törzs, ami az X-1776 sorszámot kapta, és aminek a jelen találmányban megadott eljáráshoz hasonló körülmények közötti használatkor a P2 rendelkezéseket kell figyelembe venni (Curtiss, Ann. Rev. Microbiol., 30, 507, 1976). Azokon a helyeken, ahol a P3 lehetőségek állnak fenn, az E.coli RR—1 törzset lehet használni, Ahogy ezt a plazmidok tárgyalásánál már megadtuk, a találmány szerinti eljárás vonatkozik bármely olyan gazdasejtre, amely képes felvenni a kiválasztott DNS molekulát, ilyen gazdasejt lehet a baktériumokon kívül például élesztő, abban az esetben, ha a törzsek kielégítik a National Institute of Health előírásait. A rekombináns plazmidok előállítására a restrikciós endonukleáz enzimmel kezelt plazmid DNS-t olyan cDNS molekulákkal keverjük, amelyek hasonlóan kezelt végcsoportokat tartalmaznak. Annak a lehetőségnek a csökkentésére, hogy a cDNS darabok egymással kombinálódjanak, a plazmid DNS-t a cDNS-hez képest moláris feleslegben adjuk. Az eddig ismert módszerek szerint eljárva a feleslegben adott plazmid molekulák anélkül záródtak köralakúvá, hogy beépültek volna a cDNS molekulákba. A gazdasejtbe való bejuttatás után a sejtek elsősorban plazmidot és nem cDNS rekombináns plazmidokat tartalmaztak. Ennek az eredménye az volt, hogy a szelekciós eljárás igen fá-17 rasztóvá és időrablóvá vált. Napjainkig ezt a nehézséget úgy kísérleték megoldani, hogy olyan DNS vektort terveztek, amely egy megfelelő marker gén közepén restrikciós endo- 5 nukleázra érzékeny szakaszt tartalmaz, ily módon az adott rekombinánsnak a gazdasejt DNS molekulába való beépülésekor a gén ketté vált, aminek következményeként a gén által kódolt funkció elveszett. t0 Előnyösen úgy járunk el, hogy a rekombináns plazmidok kiválasztására átvizsgálandó telepek számát kíséreljük meg csökkenteni. A módszer többek között abban áll, hogy a restrikciós endonukleáz enzimmel hasított plaz- 15 mid DNS-t alkálikus foszfatázzal kezeljük, amely enzim több forrásból, például a Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, Egyesült Államok, beszerezhető. Az alkálikus foszfatázzal való kezelés során 20 a plazmid endonukleázzal kialakított végeiről lehasadnak az 5’-terminális foszfátcsoportok, így megszűnik a lehetőség a plazmid DNS molekulák egymáshoz való kapcsolódására. Ennek az a következménye, hogy a mole- 25 kula köralakúivá való alakulása, így a transzformáció is az 5’-terminális foszfátcsoportokat tartalmazó DNS szakaszba való beépüléstől függ. Az így végzett kísérlet során a rekombináció nélkül bekövetkező transzformá- 30 ció (a gazdasejtbe való behatolás) rela tív gyakorisága 1 — 104-nél kisebb lesz. A találmány szerinti eljárás azon a tényen alapszik, hogy a DNS-ligáz enzim által katalizált reakció a DNS 5’-foszfát-végcsoportja 35 és a DNS 3’-hidroxil-végcsoportjai között következik be. Ha a terminális 5’-foszfát-csoportot eltávolítjuk, a kapcsolódási reakció nem következik be. Abban az esetben, ha kétszálú DNS molekulákat kapcsolunk össze, 40 úgy 3 lehetőség áll fenn, a lehetőségeket a 2. táblázatban mutatjuk be. 18 2, táblázat Eset Reagáló vegyületek A ligáz hatására kialakuló tennék r ii in 3' 5'----OH H2O3PO--------OPO3H2+HO----5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' OH H2O3P-O--01I+ OH----3' 5' OH HO' OH HO' 3' 3' 5'---O-P-O------------O-P-O----+2H20 5' 3' 3' 5'---Oh H0-----+H2O 5' 3' nincs reakció A 2. táblázatban a kétszálú DNS molekulákat kihúzott párhuzamos vonalakkal jelöljük, 5’- és 3’-végcsoportjaikat hidroxil- vagy 10 foszfátcsoporttal (OH vagy 0P03H2) jelöl- R jük. Az I esetben mindkét reagáló vegyület végén van 5’-foszfát-csoport, így mindkét
