193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
19386C szál kovalensen lesz kötve a reakció után. A II esetben az összekötendő szálak közül csak az egyik rendelkezik 5’-foszfát-csoporttal, aminek következményeképpen reakció után egy kovalens kötés marad fenn (egyetlen egyszálú kötés), ugyanakkor a másik szálban egy törés marad. A kovalensen nem kötött szál kapcsolatban marad az összekapcsolódott szállal, mint ahogy ez az irodalomban jól ismert, a két szálat alkotó komplementer bázispárok között kialakuló hidrogén-hidak révén. A III esetben a reagáló DNS molekulák végei nem tartalmaznak 5’-foszfát-csoportot, így a kötődési reakció nem jön létre. A nem kívánatos kötődési reakciókat oly módon akadályozhatjuk meg, hogy a megfelelő reagáló molekulák végeit, ahol a kötődést meg kívánjuk akadályozni, az ő’-foszfát-csoportok eltávolítására kezeljük. Az 5’-foszfát-csoportok hasítására bármely olyan módszert használhatunk, amely más helyeken nem sérti a DNS molekula szerkezetét. Előnyösen az alkálikus foszfatáz enzim által katalizált hídrolizises reakciót választjuk. Az előzőekben ismertetett eljárás szemléltetésére a patkány inzulin szintézisét meghatározó cDNS-t izoláljuk és egy plazmiddal rekombináljuk. Az így nyert DNS molekulákat E. coli X-1776 törzs transzformálására használjuk. A transzformánsokat tetraciklint tartalmazó táptalajon növesztve szelektáljuk. A transzformált sejtekből kapott rekombináns plazmid DNS olyan beépült DNS szakaszt tartalmazott, amely 410 nukleotidból állt. Hasonló eljárással izolált más rekombinánsokat is kaptunk és vizsgáltunk. A plazmidból a beépült DNS szakaszokat a Hind III vagy a Hsu I endonukleázzal kivitlezett emésztéssel szabadítottuk fel, majd Maxam és Gilbert módszerével (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74, 560, 1977) szekvencia-analízist végeztünk. A beépült DNS szakaszok nukleotid-sorrendje átfedő volt, és tartalmazta a patkány proinzulin I teljes kódját, továbbá a prepeptid 23 aminosav közül 13-ét. Az ismertetett szakasz nukleotid-sorrendjét az alábbiakban ismertetettek szerint készítettük el. Hasonló módon izoláltuk a patkány növekedési hormonját kódoló cDNS-t, majd plazmiddal rekombináltuk és E. coliba juttattuk. Az E. coli sejtek intenzív replikációja után olyan DNS molekulákat izoláltunk, amelyek körülbelül 800 nukleotidból álltak, és tartalmazták a patkány növekedési hormon teljes kódját, továbbá a prekurzor fehérje kódjának egy részét és az 5’-nem transzformált szakasz egy részét is. A találmány szerinti eljárás általánosan alkalmazható magasabbrendű szervezetek, köztük az ember génjeinek elkülönítésére és tisztítására, a gének mikroorganizmusokba való átvitelére és ugyanott bekövetkező replikációjukra. Olyan új rekombináns plazmidokat ismertetünk, amelyek az izolált gént teljesen vagy részben tartalmazzák. A természetben eddig ismeretlen új mikroorganizmu19 sokat írunk le, amelyek génjeikben egy magasabbrendű szervezetből származó géneket tartalmaznak. A találmány szerinti eljárás részletfeyízemléltetésére részletes példákat ismertetünk a találmány minden lépésére, a patkány inzulin génjeinek izolálására, tisztítására és bevitelére E.coli sejtekbe. A példákba jellemezzük a patkány inzulin génjét, a patkány növekedési hormonjának génjét, az ember inzulin génjét és az ember növekedési hormonjának génjét tartalmazó rekombináns plazmidokat és az ezeket a géneket tartalmazó új mikroorganizmusokat. Az 1—4. példák nem konkrétan a találmány tárgyára a növekedési hormon előállítására vonatkozik, de ezek a példák segítenek jobban megvilágítani a találmány szerinti eljárás technkai részleteit. 1. példa Ismertetjük a patkány inzulin mRNS rxtrakcióját és izolálását, az erre komplementer DNS szintézisét és a komplementer DNS jellemzését. A patkány Langerhans sejtjeinek elkülönítésére egy altatott patkány hasnyálmirigyét Hank-sóoldattal kezeljük a hasnyálmirigy rítrográd infúziójával. A Hank-sóoldat összetétele ismeretes az irodalomban, és több forrásból beszerezhető, például: Grand Island Biological Supply Company, Grand Island, New York, Egyesült Államok. Ezután eltávolítjuk a hasnyálmirigyet, a Hank-oldatban 0 C° hőmérsékleten felvagdaljuk, majd kollagenáz enzimmel és szójabab tripszin-inhibitcrral emésztjük. Minden ezt követő lépést 0’C és 4 C° közötti hőmérsékleten végzünk, kivéve ha másként nem adjuk meg. Az emésztés körülményei rendkívül fontosak. 8 ml (leljes térfogat) Hank-sóoldatban lévő két apróra vágott patkány hasnyálmirigyet 30 ml térfogatú kémcsőbe helyezünk. Az összes használt kémcsövet szilikonnal előkezeljük (a szilikon beszerzési helye a következő: márkanév:Siliclad, Clay-Adams Division, Becton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey, Egyesült Államok). Az inkubációs elegy 12 mg kollagenázt tartalmaz, amelyet Clostridium histolyticum-ből állítottak elő lényegében Mandl, Machennan és Howes módszerével (J. Clin. Invest., 32, 1323, 1943), az enzim jele CLS IV, és a beszerzési hely: Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey; az inkubációs elegy ezenfelül 1 mg, a Sigma Chemical Company-tól (St. Louis, Missouri, Egyesült Államok) vásárod tripszin-inhibitort tartalmaz. 37 C° hőmérsékleten 25 percen át inkubáljuk az elegyet, miközben percenként 90 szer kitérő rázóasztalon rázzuk. A rázatás során folyamatosan vizsgáljuk azt, hogy a kollagenáz emésztés elérte-e az optimális mértéket. Ha az inkubációs idő túl rövid, a Langerhans sejtek felszabadulása nem teljes, ug/anakkor, ha az inkubációs idő túl hosszú, egy a sejtek lízise következhet be. Az inku20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
