193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
193866 A továbbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást. A találmány során ismetrtetjük egy specifikus nukleotid-sorrendű DNS-molekula izolálásának módszerét, ennek átvitelét egy mikroorganizmusba, ahol a DNS eredeti nukleotid-sorrendje replikádé után újra kimutatható. A találmány szerinti eljárás lépéseit négy általánosan érvényes fejezetre oszthatjuk fel: 1. A kívánt sejttenyészet izolálása egy magasabbrendű szervezetből. Egy adott fehérjét meghatározó genetikai bázis-sorrendnek két lehetséges forrása van: az organizmus saját DNS-e a DNS-t másoló RNS. Az Egyesült Államok National Institutes of Hoalth jelenleg érvényes biztonsági követelményei szerint bármely emberi gént csak abban az esetben helyezhetünk rekombinálódó DNS-be, majd ezután baktériumba, ha a géneket igen gondosan tisztítottuk, vagy a kísérleteket különleges, a nagy kockázatot figyelembe vevő (P4) körülmények között végezzük (erre vonatkozóan lásd Federal Register, 41. kötet, 131 szám, 1967. július 7., 27, 902—27 943. oldal). így bármely olyan eljárást, amelynek potenciális felhasználása emberi protein előállítása lehet, mint például a jelen leírás is, az előállítandó proteint kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó mRNS izolálásával kezdünk. Ennek a módszernek az a további előnye, hogy a mRNS sokkal könnyebben tisztítható, mint a sejtből extrahált DNS. Különösen előnyösen használható fel az a tény, hogy a magasabbrendű szervezetekben, mint például a gerincesekben meghatározhatjuk a szervezeten belül azon sejtek elhelyezkedését, amelyek működése a kérdéses protein termeléséhez vezet. Előfordulhat, hogy ez a sejttenyészet az organizmus átmeneti fejlődési stádiumainak egyikében létezik. Ezekből a sejtekből izolált nagymennyiségű mRNS tartalmazza a kívánt nukleotid-szekvenciát. Az izolált mRNS tisztasága szempontjából lényeges az izolált sejtpopuláció kiválasztása és az izolálás módja. Legtöbb szövetben, mirigyben vagy szervben a sejteket fibrózus szövetháló tartja össze, amely főképpen kollagénből áll, de a szövettől függően más szerkezeti proteineket, poliszaharidokat és ásványi anyagokat is tartalmazhat. Egy adott szövetből sejteket izolálva fel kell használnunk azokat az eljárásokat, amelyek lehetővé teszik a sejtek felszabadítását a környező szöveti anyagból. Egy specifikusan differenciálódott sejttípus izolálása és tisztítása két fő lépésből áll: a sejtek elkülönítése a környező szöveti anyagból, továbbá a sejtek elkülönítése a szövetben lévő összes más típusú sejtből. A találmány szerinti eljárás során ismertetett alapelveket felhasználhatjuk egy sor más szövet sejtjeinek izolálására is. Részletesen is9 6 mertetjük a hasnyálmirigy Langerhans-szigeteinek izolálását, amelyek az'inzulint kódoló mRNS izolálására használhatók fel. Az inzulint termelő sejteket elkülöníthetjük más forrásokból is, például borjú-hasnyálmirigyből vagy tenyésztett Langerhans tumorsejtekből. A tiszta Langerhans sejtek elkülönítése ilyen esetben jóval egyszerűbb, különösen ha tiszta sejttenyészetet kívánunk használni. A későbbiekben ismertetett módszer a Langerhans sejtek izolálására ebben az esetben nem szükséges, ugyanakkor a módszer mégis előnyös általános alkalmazhatósága miatt. Sok esetben úgy találtuk, hogy az izolálandó mRNS mennyisége növelhető a tenyésztés körülményeinek változtatásával. így például hormonos kezeléssel növelhetjük az izolálható mRNS mennyiségét. Ezt elérhetjük más módszerrel is. például egy adott hőmérsékleten való tenyésztéssel, a táptalajhoz egy különleges tápanyagot, vagy más kémiai vegyületet keverve. A patkány növekedési hormonját kódoló mRNS izolálásakor az mRNS mennyisége szinergista módon és szignifikánsan nőtt. ha a tenyésztett patkány mirigysejteket tiroid hormonnal és glükokortikoidokkal kezeljük. 2. Az mRNS extrakciója A találmány szerinti eljárás lényeges része a sejt extraktumban lévő ribonukleáz enzim gyakorlatilag teljes eltávolítása. Az extrahált mRNS molekula egyszálú polinukleotid, semmiféle komplementer szálat nem tartalmaz, így egyetlen foszfodiészter-kötés hidrolitikus hasítása azt eredményezi, hogy az egész, molekula értéktelenné válik mint teljes genetikai kód. Ahogy azt az előzőekben már közöltük, a ribonukleáz enzim mindenütt előfordul, aktív és különlegesen állandó. Megtalálható a bőrön, nem veszti el aktivitását az általánosan használt mosási eljárások során, és néha még a szerves vegyületeket is szennyezi. Különösen jelentős a probléma, ha a hasnyálmirigy sejtjeinek extraktumával dolgozunk, mivel a hasnyálmirigy az emésztő enzimek forrása, így igen gazdag ribonukleázban. A ribonukleázos szennyeződés problémája azonban fennáll minden szövet esetén; a jelen szabadalmi leírásban közölt módszer a ribonukleáz aktivitás megszüntetésére minden szövetre alkalmazható. A módszer rendkívül hatásosságát a hasnyálmirigy Langerhans sejtjeiben lévő intakt mRNS sikeres izolálásával mutatjuk be. A találmány szerinti eljárás során, amikor fehérjétől gyakorlatilag mentes RNS-t izolálunk, mind a sejt feltárása, mind a további lépések során kaotrop aniont, kaotrop kationt és a diszulfid-kémiai kötéseket hasító vegyületet használunk. Az ismertetett vegyületek együttes hatását a patkány hasnyálmirigy Langerhans-szigeteiből jó kitermeléssel izolált mRNS-vel szemléltetjük, amely termék gyakorlatilag intakt molekulákat tartalmaz. 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
