193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
193866 A megfelelő kaotrop ionokat vizes elegyben való oldhatóságuk és hozzáférhetőségük alapján választjuk ki. Előnyös kaotrop kationok például a guanidium-, karbamoil-guanidium-, guanil-guanidium- és a lítium-ion. Kaotrop anionként előnyösen használhatunk jodid-, perklorát-, tiocianát, vagy például dijód-szalicilát-ionokat. Ezen kationok és anionok kombinációjakor keletkező sók relatív hatásosságát részben oldhatóságuk határozza meg. így például a lítium-dijód-szalicilát hatásosabb denatruáló-szer mint a guanidium-tiocianát, oldhatósága azonban csak körülbelül 0,1 mól és ugyanakkor viszonylag drága. A guanidium-tiocianát előnyös kation-anion-kombinációt reprezentál, mert könnyen hozzáréfhető, és vizes elegyben jól oldódik (5 mól). A tiol-származékok, mint például a ß-merkaptoetanol hasítja a fehérjét intramolekuláris diszulfid-kötéseit; a hasítás tiol-diszulfid kicserélődési reakción alapszik. Számtalan tiol-származék hatásos, köztük a ß-merkaptoetanol mellett a ditio-treitol, cisztein, propanol-dimerkaptán és mások. A vízben való oldhatóságuk lényeges, mivel a tiol-származék az intramolekuláris diszulfíd-hidakhoz képest nagy feleslegben kell hogy jelen legyen, mivel csak ekkor teljes a kicserélődési reakció. Előnyösen ß-merkaptoetanolt használunk, mivel könnyen beszerezhető és viszonylag olcsó. Az RNS sejtekből vagy szövetekből történő extrakciója során gátoljuk a ribonukleázt; egy adott kaotrop só hatása egyenesen arányos koncentrációjával. Előgyös koncentráció tehát a használható legmagasabb koncentráció. A jelen eljárás során az mRNS sérülés nélküli megőrzése az extrakció során függ a ribonukleáz denaturálásának gyorsaságától a denaturálás mértéke mellett. Valószínűleg ezért használható előnyösebben a guanidium-tiocianát, mint a guanidium-hidrogénklorid, annak ellenére, hogy az utóbbi csak kismértékben gyengébb denaturáló szer. Egy denaturáló szer hatásosságát azzal a küszöb-koncentrációval jellemezzük, amely az adott fehérje teljes denaturálódásához szükséges. Más részről sok protein denaturálódásának sebessége is függ a denaturáló szer koncentrációjától; az adott küszöb értéken ötszörös-tízszeres különbségek is lehetnek (Tanford, Adv. Prot. Chem., 23, 121, 1968). Ez az összefüggés azt jelenti, hogy a guanidium-hidrogénkloridnál csak kevéssé hatásosabb denaturáló szer egy fehérjét azonos koncentráción sokkal gyorsabban denaturálhat. A ribonukleáz denaturálódásának kinetikája és a sejtekből való extrakció közben az mRNS állandósítása közötti összefüggést a jelen leírás előtt nem ismerték fel, és nem használták, Az előzőekben ismertetett elgondolás, ha teljes mértékben igaz, azt jelenti, hogy előnyös denaturáló szer az a vegyület, amelynek a denaturálást kiváltó küszöb-koncent-11 rácója alacsony, és amely vízben jól oldódik Ezért a guanidium-tiocianátot előnyösebben használhatjuk, mint a lítium-dijód-szálicilátot, még abban az esetben is, ha az utóbbi erősebb denaturáló szer, mivel a guanidium-tioeianát oldhatósága jóval nagyobb, és így olyan koncentrációban használhatjuk, amely gyors ribonukleáz-ínaktivációt eredményez. Az előzőekben az is nyilvánvaló, miért előnyösebb a guanidium-tiocianát, mint az oldékonyabb hidrogénklorid-só. Az ok: az előző valamivel erősebb denaturáló szer. la a denaturáló szerrel egy diszulfid-kötést hasító szert együtt használunk, úgy az előbbi hatása nő, mivel a diszulfid-kötéseket hasító szer jelenléte a ribonukleáz molekulát kiegyenesíti. A tiol-származék valószínűleg növeli a denaturáció sebességét is, oly módon, hogy megakadályozza az intramolekuláris diszulfid-kötések jelenlétekor bekövetkező gyors renaturációt. Ezenfelül az mRNS készítményben szennyeződésként megmaradó ribonukleáz gyakorlatilag inaktív marad, még a denaturáló szer és a tiol hiányában is. A tiolcsoportot tartalmazó és a diszulfid-kötéseket hasító vegyületek bármely koncentrációban bizonyos mértékig hatásosak, bár általában az intramolekuláris diszulfid-kötésekre számítva nagy fölöslegben kell adnunk a tiolc'soportokat tartalmazó vegyületeket ahhoz, hogy a kicserélődési reakció az ■ ntramolekuláris diszulfid-kötések hasadása irányában folyjon. Másrészről több tiolvegyület kellemetlen szagú, és nagy koncentrációban kellemetlen a velük végzett munka, így gyakorlati szempontból létezik egy felső koncentrációhatár. Hatásosnak találtuk a ß-merkaptoetanolt, a hatásos koncent áció 0,05 mól és 1,0 mól közé esik, az előnyös koncentráció a patkány hasnyálmirigy sértetlen RNS-ének izolálásakor 0,2 mól. Az mRNS sejtből való extrakciójakor az extraháló elegy pH-ja 5,0 és 8,0 közötti. A sejt-feltárás után az RNS-t elkülönítjük a sejtben lévő proteintől és DNS-től. Erre a célra több eljárást fejlesztettek ki, bármely két használhatjuk, mindegyik jól ismert az irodalomban. Az irodalom szerinti egyik eljárás értelmében etanolos kicsapást végzünk. az etanol szelektíve kicsapja az RNS-t. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitt lezési változata szerint a kicsapási lépést kihagyjuk, és a homogenizátumot közvetlenül centrifugáló csőben lévő 5,7 mólos céziumkloridra rétegezzük. Ezután Glisin, Crkvenjakov és Byus módszere szerint (Biochemistry, 13, 2633, 1974) centrifugálunk. Ez a módszer azért előnyös, mert a körülmények az egész centrifugálás során nem kedveznek a ribonukleáz működésének, így az RNS jó kitermeléssel különíthető el, a termék mentes DNS-től és fehérjétől. A fentiek értelmében eljárva a sejthomogenizát imból megkapjuk a tiszta, teljes menynyiségű RNS-t. Az elkülönített RNS-nek csak 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
