193866. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési hormont kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid E. coli baktérium előállítására
193866 8 (2) az elválasztott mRNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal inkubáljuk, (3) az így szintetizált cDNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal vagy egy DNS polimerázzal inkubáljuk, (4) az így nyert kétszálú cDNS végeihez önmagában ismert módon olyan kapcsoló DNS láncot kapcsolunk,mely komplementer valamely E.coli plazmid restrikciós endonukleázzal végzett hasítása után keletkezett láncvégekkel, (5) valamely E.coli-ból eredő plazmidot restrikciós endonukleázzal hasítunk és a hasított plazmidról alkalikus foszfatázzal eltávolítjuk az 5’-terminális foszfát-csoportot, és (7) a kapcsoló DNS-szekvenciát tartalmazó kétszálú DNS-láncot és a kezelt plazmidot egy DNS-ligáz és ATP jelenlétében inkubáljuk. A találmány szerinti eljárást olyan specifikus DNS-sel szemléltetjük, amelyet baktériumba helyezünk, és amely tartalmazza a patkány preproinzulinjának, a patkány növekedési hormonjának és az ember növekedési hormonjának génjeit. Ezzel bizonyítjuk, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmas bármely magasabbrendű szervezetből, például gerincesekből származó DNS bevitelére bármely mikroorganizmusba. Magasabbrendű szervezetek alatt értjük az eukariota szervezeteket, amelyeknek differenciált szöveteik vannak, például a rovarok, puhatestűek, növények, gerincesek, köztük az emlőzök, mint például a szarvasmarhák, sertések, vagy maga az ember. Mikroorganizmusként használhatunk bármely mikroszkopikus élő szervezetet, mint például protozoát, prokariotát vagy cukariotát, mint például baktériumokat, protozoákat, algákat vagy gombákat, mint például élesztőket. A találmány szerinti eljárás során először továbbfejlesztett eljárással elkészítjük a kiválasztott sejttenyészetet. A sejtekből új eljárással sértetlen mRNS-t extrahálunk, miközben gyakorlatilag a teljes ribonukleáz aktivitást gátoljuk. A sértetlen mRNS-t oszlopkromatográfiával különítjük el az extraktumból, majd a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében a reverz transzkriptáz enzim hatásának tesszük ki, amiután megkapjuk a komplementer (cDNS) dezoxi-ribonukleinsav szálat. A reverz transzkriptáz enzimmel kivitelezett első reakció után a termékből szelektíve eltávolítjuk a megfelelő ribonukleotid-szekvenciát tartalmazó részt. Az így kapott dezoxi-nukleotid-molekulát, amely az eredeti mRNS-vel komplementer, a reverz transzkriptáz vagy a DNS-polimeráz és a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében inkubáljuk. Az így kapott vegyület egy kettős szálú cDNS molekula, amely az egyik végüknél egyszálú hurokkal összekapcsolt komplemen ter szálakból áll. Ezt a vegyületet ezután az egyszálú darabra specifikus nukleáz-7 zal reagáltatjuk, amely enzim lehasítja az egyszálú hurkot. A reakció után kapott kétszálú -cDNS-t ezután meghosszabbítjuk oly módon, hogy mindkét végéhez hozzákapcsolunk egy a restrikciós enzimre érzékeny bázis-szekvenciát tartalmazó specifikus DNS-t. Ezt a reakciót a DNS-ligáz enzim katalizálja. A meghosszabbított -cDNS.-t ezután a restrikciós endonukleázzal kezeljük, amely mindegyik szál 5’-végén önmagára komplementer egyszálú végeket tartalmazó kétszálú molekulát hoz létre. A plazmid DNS-t, amely ugyanarra a restrikciós endonukleázra érzékeny bázis-szekvenci át tartalmaz, reagáltatjuk az enzimmel, amikor lehasad a polinukleotid-szál, és olyan molekulát kapunk, amely az 5’-végen önmagában komplementer egyszálú darabot tartalmaz. Ezután eltávolítjuk az egyszálú DNS darab 5’-terminális foszfát-csoportjait, abból a célból, hogy megakadályozzuk a plazm dot a gyűrűs szerkezet felvételében. Az előállított cDNS-t és a plazmid DNS-t a DNS-ligáz jelenlétében együtt inkubáljuk. A későbbiekben részletesen megadott reakciókörülmények között csak abban az esetben jön létre a plazmid DNS-ből előnyös tulajdonságú, két végén zárt gyűrű, ha a cDNS-ből egy darab beépül a molekulába. A cDNS-szekvenciát tartalmazó plazmidot ezután bejuttatjuk a megfelelő gazdasejtbe. Az életképes plazmidot befogadó sejteket úgy mutatjuk ki, hogy az ezekből a sejtedből kifejlődött telepek a plazmid által megha'ározott genetikai tulajdonsággal rendelkeznek, például rezisztensek bizonyos gyógyszerekre. A beépített cDNS darabot hordozó refombináns plazmidot tartalmazó tiszta baktérium törzseket ezután tenyésztjük, majd újra izoláljuk a rekombináns plazmidot. Ily módon nagymennyiségű rekombinálódott plazmid DNS-t különíthetünk el, a specifikus cDNS darabot ebből a megfelelő restrikció? enzim endonukleotikus hatását kihasználva elkülöníthetjük. A találmány szerinti eljárás alaplépése bármely magasabbrendű szervezetből, például az emberből nyert nukleotid-szekvencia izolálása és bevitele egy mikroorganizmusba. A találmány szerinti eljárást felhasználhatjuk egy gyógyszerészeti vagy ipari értékű különleges protein szintézisét meghatározó gén átv telére és ennek a proteinnek a mikrobiológiai szintézisére. A találmány szerinti eljárás szemléltetésére a patkány inzulint kódoló nukleotid-darabot izoláltuk, baktériumokba juttattuk és ott replikáitok. Ugyancsak izoláltuk a patkány növekedési homonját meghatározó nukleotid-darabot, majd ezt baktériumokba juttattuk, és ott replikáltuk. A találmány szerinti eljárás felhasználható az emberből izolált DNS átvitelére, így példám az emberi inzulin és növekedési hormon, vagy más polipeptid hormonok átvitelre is. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
